Proprietăți enzimatice

1. Dependența vitezei de reacție de temperatură

Este descrisă dependența activității enzimei (viteza de reacție) de temperatură curba clopotuluicu viteza maximă la valori temperatura optimă pentru o anumită enzimă... O creștere a vitezei de reacție la apropierea de temperatura optimă se explică printr-o creștere a energiei cinetice a moleculelor care reacționează.

Dependența vitezei de reacție de temperatură

Legea privind creșterea vitezei de reacție de 2-4 ori cu o creștere a temperaturii cu 10 ° C este valabilă și pentru reacțiile enzimatice, dar numai în intervalul de până la 55-60 ° C, adică la temperaturi denaturareproteine. Odată cu scăderea temperaturii, activitatea enzimelor scade, dar nu dispare complet.

Ca excepție, există enzime ale unor microorganisme care există în apa izvoarelor termale și gheizerelor, temperatura optimă a acestora se apropie de punctul de fierbere al apei. Un exemplu de activitate slabă la temperaturi scăzute este hibernarea unor animale (veverițe de sol, arici), a căror temperatură corporală scade la 3-5 ° C. Această proprietate a enzimelor este utilizată și în practica chirurgicală în timpul operațiilor pe cavitatea toracică, când pacientul este răcit la 22 ° C.

Enzimele pot fi foarte sensibile la schimbările de temperatură:

• pisicile siameze au botul, vârfurile urechilor, coada, labele de culoare neagră. În aceste zone, temperatura este cu doar 0,5 ° C mai mică decât în \u200b\u200bzonele centrale ale corpului. Dar acest lucru permite să funcționeze enzima care formează pigmentul din foliculii de păr; la cea mai mică creștere a temperaturii, enzima este inactivată,
• caz opus - când temperatura ambiantă scade în iepurele alb, enzima care formează pigmentul este inactivată și iepurele primește o blană albă,
• proteine \u200b\u200bantivirale interferon începe să fie sintetizat în celule numai atunci când temperatura corpului atinge 38 ° C,

Există, de asemenea, situații unice:

• pentru majoritatea oamenilor, o creștere a temperaturii corpului cu 5 ° C (până la 42 ° C) este incompatibilă cu viața din cauza unui dezechilibru în rata reacțiilor enzimatice. În același timp, s-a constatat că unii sportivi au o temperatură corporală de aproximativ 40 ° C în timpul alergării maratonului, temperatura corporală maximă înregistrată a fost de 44 ° C.

2. Dependența vitezei de reacție de pH

De asemenea, este descrisă dependența curba clopotului cu viteza maximă la optim pentru această enzimă Valoarea pH-ului.

Această caracteristică a enzimelor este esențială pentru adaptarea organismului la schimbarea condițiilor externe și interne. Schimbările valorii pH-ului în afara și în interiorul celulei joacă un rol în patogeneza bolilor, schimbând activitatea enzimelor din diferite căi metabolice.

Pentru fiecare enzimă, există un anumit interval îngust de pH al mediului, care este optim pentru manifestarea celei mai înalte activități. De exemplu, valorile optime ale pH-ului pentru pepsină sunt 1,5-2,5, tripsina 8,0-8,5, amilază salivară 7,2, arginază 9,7, fosfatază acidă 4,5-5,0, succinat dehidrogenază 9,0.

Dependența vitezei de reacție de valoarea pH-ului

Dependența activității de aciditatea mediului se explică prin prezența aminoacizilor în structura enzimei, a cărei sarcină se modifică cu o schimbare a pH-ului (glutamat, aspartat, lizină, arginină, histidină). O schimbare a încărcării radicalilor acestor aminoacizi duce la o schimbare a interacțiunii lor ionice în timpul formării structurii terțiare a proteinei, o modificare a sarcinii sale și apariția unei configurații diferite centru activ și, prin urmare, substratul se leagă sau nu se leagă de locul activ.

Schimbarea activității enzimelor cu o schimbare a pH-ului poate duce și adaptativ funcții. De exemplu, în ficat, enzimele gluconeogenezei necesită un pH mai scăzut decât enzimele glicolizei, care este combinat cu succes cu acidificarea fluidelor corporale în timpul postului sau al activității fizice.

Pentru majoritatea oamenilor, modificările valorilor pH-ului din sânge peste 6,8-7,8 (cu o rată de 7,35-7,45) sunt incompatibile cu viața din cauza unui dezechilibru în rata reacțiilor enzimatice. În același timp, unii alergători de maraton au arătat o scădere a pH-ului sângelui la sfârșitul distanței la 6,8-7,0. Și totuși, în același timp, au rămas funcționale!

3. Dependența de cantitatea de enzimă

Cu o creștere a numărului de molecule enzimatice, viteza de reacție crește continuu și este direct proporțională cu cantitatea de enzimă, deoarece mai multe molecule de enzime produc mai multe molecule de produs.

A). Dependența vitezei reacției enzimatice de cantitatea de enzime

Atunci când se efectuează o reacție enzimatică în condiții de exces de substrat, viteza de reacție va depinde de concentrația enzimei. Dependența grafică a unei astfel de reacții are forma unei linii drepte. Cu toate acestea, cantitatea de enzimă este adesea imposibil de determinat în valori absolute, prin urmare, în practică, se utilizează valori convenționale care caracterizează activitatea enzimei: o unitate de activitate internațională (ME) corespunde cantității de enzimă care catalizează conversia a 1 μmol de substrat în 1 min în condiții optime pentru reacția enzimatică. Condițiile optime sunt individuale pentru fiecare enzimă și depind de temperatura mediului, de pH-ul soluției, în absența activatorilor și inhibitorilor.

Dependența acumulării produsului (A) și a pierderii substratului (B) de timpul (durata) reacției... Viteza reacției enzimatice este determinată de modificarea concentrației produsului sau a substratului pe unitate de timp. În reacțiile catalizate de enzimele 1 și 2, viteza inițială a reacției catalizate de enzima 1 este mai mică decât rata reacției catalizate de enzima 2, deoarece tangenta pantei tangentei la curba profilului de reacție trasată din punctul "O" al celei de-a doua enzime este mai mare, deoarece în cazul acumulării produsului (A) și pierderii substratului (B). Viteza la orice moment t este determinată de tangenta unghiului de înclinare a tangentei la profilul de reacție la momentul t. Perioada de timp a reacției enzimatice este caracterizată prin acumularea liniară a produsului (sau pierderea substratului) în funcție de durata reacției. Perioada reacției enzimatice se caracterizează prin acumularea neliniară a produsului (sau pierderea substratului) în funcție de timpul de reacție.

Numărul de unități de activitate nME este determinat de formula:

B). Dependența vitezei reacției enzimatice de temperatura mediului

O creștere a temperaturii la anumite limite afectează rata enzimatică

reacțiile sunt similare cu efectul temperaturii asupra oricărei reacții chimice. Odată cu creșterea temperaturii, mișcarea moleculelor se accelerează, ceea ce duce la o creștere a probabilității de interacțiune a substanțelor care reacționează. În plus, temperatura poate crește energia moleculelor care reacționează, ceea ce accelerează și reacția. Cu toate acestea, viteza reactie chimica, catalizat de enzime, are propria sa temperatură optimă, depășind ceea ce este însoțit de o scădere a activității enzimatice care rezultă din denaturarea termică a moleculei de proteină

Pentru majoritatea enzimelor umane, temperatura optimă este de 37-38 ° C. Cu toate acestea, enzimele termostabile există și în natură. De exemplu, polimeraza Taq, izolată din microorganismele care trăiesc în izvoarele termale, nu este inactivată atunci când temperatura crește la 95 ° C. Această enzimă este utilizată în medicina științifică și practică pentru diagnosticarea moleculară a bolilor folosind metoda reacției în lanț a polimerazei (PCR).

ÎN). Dependența vitezei reacției enzimatice de cantitatea de substrat

Cu o creștere a cantității de substrat, rata inițială crește. Când enzima devine complet saturată cu substratul, adică formarea maximă posibilă a complexului enzimă-substrat are loc la o concentrație dată de enzimă, se observă cea mai mare rată de formare a produsului. O creștere suplimentară a concentrației substratului nu duce la o creștere a formării produsului, adică viteza de reacție nu crește. Această stare corespunde vitezei maxime de reacție Vmax.

Astfel, concentrația enzimei este un factor limitativ în formarea produsului. Această observație a stat la baza cineticii enzimatice dezvoltată de oamenii de știință L. Michaelis și M. Menten în 1913.

Viteza de reacție este proporțională cu concentrația complexului ES-enzimă-substrat, iar viteza de formare a ES depinde de concentrația substratului și de concentrația enzimei libere. Concentrația ES este influențată de rata formării și degradării ES.

Cea mai mare viteză reacțiile sunt observate atunci când toate moleculele enzimatice se află într-un complex cu substratul, adică în complexul enzimă-substrat ES, adică [E] \u003d.

Dependența vitezei reacției enzimatice de concentrația substratului este exprimată prin următoarea ecuație (derivarea matematică a acestei formule poate fi găsită în manuale despre cinetica enzimatică):

V \u003d Vmax [S] / Km + [S]

Această ecuație se numește ecuația Michaelis-Menten.

Ecuația Michaelis-Menten este ecuația de bază a cineticii enzimatice care descrie dependența ratei unei reacții enzimatice de concentrația substratului.

Dacă concentrația substratului este semnificativ mai mare decât Km (S \u003e\u003e Km), atunci o creștere a concentrației substratului cu valoarea Km practic nu afectează suma (Km + S) și poate fi considerată egală cu concentrația substratului. În consecință, viteza de reacție devine egală cu viteza maximă: V \u003d Vmax. În aceste condiții, reacția are un ordin zero, adică nu depinde de concentrația substratului. Se poate concluziona că Vmax este o valoare constantă pentru o concentrație dată de enzimă, independent de concentrația substratului.

Dacă concentrația substratului este semnificativ mai mică de Km (S<< Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).

Vmax și Km sunt caracteristici cinetice ale eficienței enzimei.

Vmax caracterizează activitatea catalitică a enzimei și are dimensiunea vitezei reacției enzimatice mol / L, adică determină posibilitatea maximă de formare a produsului la o anumită concentrație de enzime și în condiții de exces de substrat. Km caracterizează afinitatea unei enzime date cu un substrat dat și este o valoare constantă independentă de concentrația enzimei. Cu cât este mai mic Km, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru un substrat dat, cu atât este mai mare viteza de reacție inițială și invers, cu cât este mai mare Km, cu atât este mai mică viteza de reacție inițială, cu atât este mai mică afinitatea enzimei pentru substrat.

După cum știți, rata unei reacții chimice, conform regulii van't Hoff, crește de 2-4 ori atunci când temperatura crește cu 10 °. Cu toate acestea, pentru reacțiile enzimatice se observă doar până la 50-60 o C. La temperaturi mai ridicate, enzima, care este o proteină, se denaturează, se modifică conformația sa și nu mai poate îndeplini funcțiile sale catalitice. Prin urmare, dependența vitezei reacției enzimatice de temperatură are forma unei curbe cu un maxim (figura)

Maximul corespunde cu cel mai mare activitateenzimă, care este de obicei măsurată prin cantitatea sa în mg, care catalizează 1 mg mol de substrat în 1 min. Activitate specificămăsurat pe 1 mg de enzimă (mgmol / min). Activitatea molară (numărul de revoluții sau constanta catalitica)se calculează per mgmol de enzimă (mgmol / mgmol ∙ × min), adică activitatea molară arată câte molecule de substrat sunt convertite în 1 minut de o moleculă enzimatică.

În plus față de temperatură, activitatea enzimelor este afectată de pH-ul mediului și de prezența inhibitorilor.

Efectul pH-ului asupra vitezei de reacție enzimatică

Pentru majoritatea reacțiilor enzimatice, valoarea pH-ului optim al mediului se află în intervalul 5-9. Curba de dependență a vitezei reacției enzimatice de pH este o curbă cu un maxim (figura)

Acest tip de curbă se datorează faptului că există o stare optimă de ionizare a substratului și a moleculei proteice a enzimei (reziduurile sale de aminoacizi), care asigură conexiunea lor cea mai stabilă în centrul activ și, în consecință, cea mai mare viteză de reacție.

Inhibitori enzimatici

Acțiunea enzimelor poate fi slăbită sau complet suprimată cu ajutorul anumitor substanțe - inhibitori... Acțiunea lor poate fi reversibilă și ireversibilă.

Inhibitori reversibilise leagă de obicei de enzimă prin legături necovalente și se pot desprinde cu ușurință de acestea, în timp ce există așa-numitele inhibitori reversibili competitivi,care au structuri similare cu substratul și tind, fiecare în primul rând, să se lege de enzimă la locul de legare a substratului din centrul activ. Dacă inhibitorului competitiv I și substratului S se adaugă enzimei E, atunci se formează doi complexe în funcție de reacții:

E + S «ES ® P + E

Е + I «Е I ≠ Р

Deoarece formarea complexului EI nu duce la formarea de produse de reacție, viteza de reacție a formării lor scade, deoarece numărul de centre active ale enzimei care pot interacționa cu substratul scade. Deoarece inhibitorul competitiv se leagă de enzimă reversibil, efectul său poate fi redus prin creșterea concentrației substratului, deoarece acest lucru crește probabilitatea de legare a enzimei la substrat. Inhibitorul, interferând cu formarea complexului enzimă-substrat, crește constanta Michaelis K m, dar nu modifică V max.

Inhibitor reversibil necompetitivnu seamănă cu structura, cu substratul, prin urmare se poate lega de enzimă în prezența și în absența substratului și, de obicei, se leagă de enzimă nu în centrul activ, ci într-un alt loc, de obicei în centrul de reglare. În acest caz, se formează un complex triplu: enzimă-inhibitor-substrat (ESI), care nu duce la formarea de produse de reacție:

E + S + I ® E I ≠ P

Cu acest tip de inhibiție, efectul inhibitorului nu poate fi depășit prin creșterea concentrației substratului. Inhibitorul reversibil necompetitiv reduce atât Vmax cât și Km.

Inhibitori ireversibilienzimele sunt compuși care formează legături puternice cu enzima și se află în centrul său activ. Legând grupuri importante de site-ul de legare a substratului, acestea își schimbă ireversibil configurația. Acesta este modul în care ionii de metale grele Hg +2 și Pb +2 acționează ireversibil asupra enzimelor, ceea ce explică efectul lor toxic asupra corpului uman.

Reglarea acțiunii enzimelor este efectuată de hormoni.

BIOCHIMIE DINAMICĂ

Se numește setul de reacții chimice care apar în celulele vii și care furnizează organismului substanțele și energia de care are nevoie metabolism sau metabolism.Distinge catabolism și anabolism. Transformarea catabolică este descompunerea moleculelor complexe, ambele furnizate cu alimente și în celulă, aceste procese sunt numite exogonice.

Procesele anabolice (procese de biosinteză) vizează formarea și reînnoirea elementelor structurale ale celulelor, adică la sinteza moleculelor complexe din cele simple. Procesele de biosinteză sunt procese de restaurare și sunt însoțite de cheltuirea energiei libere, astfel de procese sunt numite endergonice. Ambele părți ale procesului sunt interconectate în timp și spațiu. Procesele catabolice și anabolice apar în diferite organite celulare, unde se află diferite enzime intracelulare. Toate căile metabolice sunt interconectate, așa cum se arată pe circuitul integrat al căilor metabolice.

Odată cu creșterea temperaturii mediului, viteza reacției enzimatice crește, atingând un maxim la o anumită temperatură optimă, apoi scade la zero. Pentru reacțiile chimice, există o regulă conform căreia atunci când temperatura crește cu 10 ° C, viteza de reacție crește de două până la trei ori. Pentru reacțiile enzimatice, acest coeficient de temperatură este mai mic: pentru fiecare 10 ° C, viteza de reacție crește de 2 ori sau chiar mai puțin. Scăderea ulterioară a vitezei de reacție la zero indică denaturarea blocului enzimatic. Valorile optime ale temperaturii pentru majoritatea enzimelor sunt cuprinse între 20 - 40 0 \u200b\u200bC. Stabilitatea termică a enzimelor este asociată cu structura proteinelor lor. Unele enzime sunt denaturate deja la o temperatură de aproximativ 40 ° C, dar cele mai multe dintre ele sunt inactivate la temperaturi peste 40-50 ° C. Unele enzime sunt inactivate de frig, adică la temperaturi apropiate de 0 ° C, apare denaturarea.

O creștere a temperaturii corpului (febră) accelerează reacțiile biochimice catalizate de enzime. Este ușor de calculat că o creștere a temperaturii corpului pentru fiecare grad crește viteza de reacție cu aproximativ 20%. La temperaturi ridicate de aproximativ 39-40 ° C, este necesară utilizarea risipitoare a substraturilor endogene în celulele unui organism bolnav pentru a-și reface aportul cu alimente. În plus, la o temperatură de aproximativ 40 ° C, unele dintre enzimele extrem de termolabile pot fi denaturate, ceea ce perturbă cursul natural al proceselor biochimice.

Temperatura scăzută determină inactivarea reversibilă a enzimelor datorită unei ușoare modificări a structurii sale spațiale, dar suficientă pentru a perturba configurația corespunzătoare a centrului activ și a moleculelor substratului.

Dependența vitezei de reacție de pH-ul mediului

Majoritatea enzimelor au o anumită valoare a pH-ului la care activitatea lor este maximă; deasupra și sub acest pH, activitatea acestor enzime scade. Cu toate acestea, nu în toate cazurile, curbele care descriu dependența activității enzimei de pH sunt în formă de clopot; uneori această dependență poate fi exprimată și direct. Dependența vitezei reacției enzimatice de pH indică în principal starea grupelor funcționale ale centrului activ al enzimei. O modificare a pH-ului mediului afectează ionizarea grupurilor acide și bazice de reziduuri de aminoacizi din centrul activ, care sunt implicate fie în legarea substratului (în locul de contact), fie în transformarea acestuia (în situl catalitic). Prin urmare, efectul specific al pH-ului poate fi cauzat fie de o modificare a afinității substratului pentru enzimă, fie de o modificare a activității catalitice a enzimei, sau de ambele.

Majoritatea substraturilor au grupe acide sau bazice, deci pH-ul afectează gradul de ionizare al substratului. Enzima se leagă de preferință fie la o formă ionizată, fie neionizată a substratului. Evident, la un pH optim, grupurile funcționale ale centrului activ sunt în starea cea mai reactivă, iar substratul este în forma preferată pentru legarea de către aceste grupări ale enzimei.

Când se trasează curbe care descriu dependența activității enzimei de pH, măsurătorile la toate valorile pH-ului se efectuează de obicei în condiții de saturație a enzimei cu un substrat, deoarece valoarea Km pentru multe enzime se modifică cu pH-ul.

Curba care caracterizează dependența activității enzimei de pH poate avea o formă deosebit de simplă în cazurile în care enzima acționează pe substraturi sau substraturi electrostatice neutre în care grupurile încărcate nu joacă un rol semnificativ în actul catalitic. Un exemplu de astfel de enzime este papaina, precum și invertaza, care catalizează hidroliza moleculelor de zaharoză neutră și păstrează o activitate constantă în domeniul pH-ului 3.0-7.5.

Valoarea pH-ului corespunzătoare activității maxime a enzimei nu coincide neapărat cu valoarea pH-ului caracteristic mediului intracelular normal al acestei enzime; acesta din urmă poate fi peste sau sub pH-ul optim. Acest lucru sugerează că efectul pH-ului asupra activității enzimatice poate fi unul dintre factorii responsabili pentru reglarea activității enzimatice în interiorul celulei. Deoarece celula conține sute de enzime și fiecare dintre ele reacționează diferit la modificările pH-ului, valoarea pH-ului din interiorul celulei este probabil unul dintre elementele importante din sistemul complex de reglare a metabolismului celular.

Introducere

Una dintre manifestările caracteristice ale vieții este capacitatea organismelor vii de a regla cinetic reacțiile chimice, suprimând dorința de a atinge un echilibru termodinamic. Cinetica enzimatică studiază regularitățile influenței naturii chimice a substanțelor care reacționează (enzime, substraturi) și condițiile de interacțiune a acestora (concentrația, pH-ul mediului, temperatura, prezența activatorilor sau inhibitorilor) asupra vitezei unei reacții enzimatice. Scopul principal al studierii cineticii reacțiilor enzimatice este obținerea de informații care pot ajuta la clarificarea mecanismului molecular de acțiune enzimatică.

Dependența vitezei reacției enzimatice de concentrația substratului

inhibitor biochimic al substratului enzimatic

Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică reacțiilor enzimatice. Se știe că orice reacție chimică este caracterizată printr-o constantă de echilibru termodinamic. Exprimă starea de echilibru chimic realizată de sistem și este notată cu Cr. Deci, pentru o reacție:

constanta de echilibru este egală cu produsul concentrațiilor substanțelor rezultate împărțit la produsul concentrației substanțelor inițiale. Valoarea constantei de echilibru se găsește de obicei din raportul dintre constantele de viteză ale reacțiilor directe (k + 1) și inversă (k-1), adică

Într-o stare de echilibru, viteza de reacție directă este:

v + 1 \u003d k + 1 [A] * [B]

este egală cu viteza reacției inverse:

v-1 \u003d k-1 [C] * [D],

acestea. v + 1 \u003d v-1

respectiv k + 1 [A] * [B] \u003d k-1 [C] * [D],

Figura: unu.

reacții de la concentrația substratului la concentrație constantă

enzimă

a - reacție de primul ordin (la [S]<Кm скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата); б - реакция смешанного порядка; в - реакция нулевого порядка, когда v = Vmaxi скорость реакции не зависит от концентрации субстрата.

Astfel, constanta de echilibru este egală cu raportul dintre constantele de viteză ale reacțiilor înainte și invers. Reciprocitatea constantei de echilibru se numește de obicei constantă substrat sau, în cazul unei reacții enzimatice, constantă de disociere a complexului enzimă-substrat și notată cu simbolul KS. Deci, în reacție

acestea. KS este egal cu raportul dintre produsul concentrației enzimei și substratului la concentrația complexului enzimă-substrat sau raportul dintre constantele de viteză ale reacțiilor inverse și directe. Trebuie remarcat faptul că constanta KS depinde de natura chimică a substratului și a enzimei și determină gradul de afinitate al acestora. Cu cât valoarea KS este mai mică, cu atât afinitatea enzimei pentru substrat este mai mare.

Atunci când se studiază cinetica reacțiilor enzimatice, trebuie luată în considerare o caracteristică importantă a acestor reacții (care nu este caracteristică reacțiilor chimice obișnuite), asociată cu fenomenul de saturație a enzimei cu un substrat. La o concentrație scăzută a substratului, dependența vitezei de reacție de concentrația substratului (Fig. 1) este aproape liniară și respectă cinetica de ordinul întâi. Aceasta înseamnă că viteza de reacție S -\u003e P este direct proporțională cu concentrația substratului S și în orice moment t este determinată de următoarea ecuație cinetică:

unde [S] este concentrația molară a substratului S; -d [S] / dt - rata pierderii substratului; k "este constanta vitezei de reacție, care în acest caz are o dimensiune inversă unității de timp (min-1 sau s-1).

La o concentrație mare a substratului, viteza de reacție este maximă, devine constantă și nu depinde de concentrația substratului [S]. În acest caz, reacția respectă cinetica de ordinul zero v \u003d k "(cu saturația completă a enzimei cu substratul) și este în întregime determinată de concentrația enzimatică. În plus, se disting reacțiile de ordinul doi, a căror rată este proporțională cu produsul concentrațiilor celor două substanțe care reacționează. În anumite condiții, atunci când proporționalitatea este încălcată, se spune uneori despre reacțiile de ordin mixt (vezi Fig. 1).

Studiind fenomenul saturației, L. Michaelis și M. Menten au dezvoltat o teorie generală a cineticii enzimatice. Au plecat de la presupunerea că procesul enzimatic se desfășoară sub forma următoarei reacții chimice:

acestea. enzima E interacționează cu substratul S cu formarea unui complex intermediar ES, care se descompune în continuare într-o enzimă liberă și un produs de reacție P. Prelucrarea matematică bazată pe legea acțiunii de masă a făcut posibilă derivarea unei ecuații numite după autori prin ecuația Michaelis-Menten, care exprimă relația cantitativă dintre concentrația substratului și viteza reacției enzimatice:

unde v este viteza de reacție observată la o concentrație de substrat dată [S]; KS este constanta de disociere a complexului enzimă-substrat, mol / l; Vmax este viteza maximă de reacție atunci când enzima este complet saturată cu substratul.

Din ecuația Michaelis-Menten rezultă că la o concentrație mare de substrat și o valoare KS scăzută, viteza de reacție este maximă, adică v \u003d Vmax (reacție de ordin zero, vezi Fig. 1). La o concentrație scăzută de substrat, dimpotrivă, viteza de reacție este proporțională cu concentrația de substrat în orice moment dat (reacție de ordinul întâi). Trebuie remarcat faptul că ecuația Michaelis-Menten în forma sa clasică nu ia în considerare efectul produselor de reacție asupra vitezei procesului enzimatic, de exemplu, în reacție

și este oarecum limitat. Prin urmare, s-au încercat îmbunătățiri. Deci, a fost propusă ecuația Briggs-Haldane:

unde Km este constanta lui Michaelis, care este o cantitate determinată experimental. Poate fi reprezentat prin următoarea ecuație:

Figura: 2. - Curba ecuației Michaelis-Menten: hiperbolică

dependența de ratele inițiale ale reacției catalizate de enzime

asupra concentrației substratului

Numărătorul arată constantele de viteză pentru descompunerea complexului ES în două direcții (spre E și S inițiale și către produsele finale ale reacției E și P). Raportul k-1 / k + 1 este constanta de disociere a complexului enzimă-substrat KS, atunci:

O consecință importantă rezultă din aceasta: constanta Michaelis este întotdeauna mai mare decât constanta de disociere a complexului enzimă-substrat KS cu valoarea k + 2 / k + 1.

Pentru a determina valoarea numerică a Km, concentrația substratului se găsește de obicei la care viteza reacției enzimatice V este jumătate din Vmax maxim, adică dacă V \u003d 1/2 Vmax. Înlocuind valoarea lui V în ecuația Briggs-Haldane, obținem:

împărțind ambele părți ale ecuației cu Vmax, obținem

Astfel, constanta Michaelis este numerică egală cu concentrația substratului (mol / L) la care viteza acestei reacții enzimatice este jumătate din maximă.

Determinarea valorii Km este importantă pentru elucidarea mecanismului de acțiune al efectorilor asupra activității enzimei etc. Constanta Michaelis poate fi calculată din grafic (Fig. 2). Segmentul de pe abscisă corespunzător vitezei egale cu jumătate din viteza maximă va fi Km.

Este incomod să se utilizeze graficul reprezentat în coordonate directe ale dependenței vitezei de reacție inițiale v0 de concentrația inițială a substratului, deoarece viteza maximă Vmax este în acest caz o valoare asimptotică și nu este determinată suficient de exact.

Figura: 3.

Pentru o prezentare grafică mai convenabilă a datelor experimentale, G. Lineuver și D. Burke au transformat ecuația Briggs-Haldane prin metoda reciprocelor duble bazate pe principiul că, dacă există egalitate între oricare două mărimi, atunci și cantitățile reciproce vor fi egale. În special, dacă

apoi după transformare obținem ecuația:

care se numește ecuația Lineweaver-Burke. Aceasta este ecuația liniei drepte:

Dacă acum, în conformitate cu această ecuație, construiți un grafic în coordonatele 1 / v (y) din l / [S] (x), atunci obținem o linie dreaptă (Fig. 3), a cărei pantă va fi egală cu valoarea Km / Vmax; segmentul tăiat de linia dreaptă de pe axa ordonată este l / Vmax (reciproc al vitezei maxime).

Dacă continuăm linia dreaptă dincolo de axa ordonatelor, atunci un segment corespunzător valorii reciproce a constantei Michaelis - 1 / Km este tăiat pe abscisă (vezi Fig. 3). Astfel, valoarea Km poate fi calculată din datele pantei liniei drepte și a lungimii segmentului tăiat de pe axa ordonatelor, sau din lungimea segmentului tăiat de pe axa abscisei în regiunea valorilor negative.

Trebuie subliniat faptul că valorile Vmax, precum și valoarea Km, pot fi determinate mai precis din graficul reprezentat în coordonate directe folosind graficul reprezentat grafic folosind metoda dublă reciprocă. Prin urmare, această metodă a găsit o largă aplicare în enzimologia modernă. Sunt propuse și metode grafice similare pentru determinarea Km și Vmax în coordonatele v versus v / [S] și [S] / v versus [S].

Trebuie remarcate unele limitări ale aplicării ecuației Michaelis-Menten, datorită formelor multiple de enzime și naturii alosterice a enzimei. În acest caz, graficul dependenței vitezei inițiale de reacție de concentrația substratului (cinetic

Figura: 4.

curba) nu are o formă hiperbolică, ci un caracter sigmoid (Fig. 4), similar cu curba de saturație a hemoglobinei cu oxigen. Aceasta înseamnă că legarea unei molecule de substrat într-un centru catalitic mărește legarea substratului de un alt centru, adică există o interacțiune cooperantă, ca în cazul adăugării de oxigen la cele 4 subunități ale hemoglobinei. Pentru a estima concentrația substratului la care viteza de reacție este jumătate din maximă, în condițiile naturii sigmoide a curbei cinetice, se folosește de obicei ecuația Hill transformată:

unde K "este constanta de asociere; n este numărul de centre de legare a substratului.