TUBERCULOZA DIAGNOSTICĂ LA COPII

AND TEENAGERS

Bogdanova E.V., Kiselevich OK

Departamentul de Ftiziopulmonologie, Universitatea de Stat de Medicină din Rusia

Absența simptomelor clinice specifice și varietatea manifestărilor clinice de tuberculoză la copii creează dificultăți semnificative în diagnosticul bolii. Prin urmare, condiția principală pentru diagnosticarea în timp util a tuberculozei este o examinare cuprinzătoare a pacientului, care este efectuată de un medic TB.

Identificarea copiilor care au nevoie de consultare cu un medic ftiziolog este efectuată de pediatrii din rețeaua medicală generală la locurile de muncă și în spitale. Un pediatru trebuie să cunoască grupurile de risc pentru tuberculoză la copii și adolescenți. Copiii și adolescenții din aceste grupuri trebuie trimise în timp util pentru a se consulta cu un specialist în TBC. În plus, pediatrul trebuie să se ocupe de diagnosticul diferențial al tuberculozei și al altor boli.

Diagnosticul leziunilor tuberculoase la copii este dificil. Manifestările clinice sunt diverse, dar nu au caracteristici strict specifice. Tuberculoza la copii apare adesea sub măștile diferitelor boli - ARVI, bronșită etc.

Pentru a diagnostica tuberculoza, medicul TB foloseste un set de metode de examinare obligatorie - Minim de diagnosticare obligatorie (ODM) care include:

1. Colectarea anamnezei: identificarea sursei și modalităților de infectare a unui copil MBT, identificarea factorilor medicali și sociali adversi, evaluarea dinamicii sensibilității la tuberculină într-un test Mantoux cu 2TE PPD-L;

2. Identificați reclamațiile. O atenție deosebită este acordată plângerilor privind apetitul proast, somnul neliniștit, oboseala, iritabilitatea, în rândul elevilor - la scăderea memoriei, atenției, deteriorării performanței, durerilor de cap; creșterea temperaturii, etc;

3. Metode de inspecție și examinare fizică;

1) Examinarea cu raze X vă permite să vizualizați modificări ale plămânilor și / sau ale ganglionilor limfatici intrathoracici, caracteristice diferitelor forme de tuberculoză. În acest scop, efectuați o radiografie a pieptului în proiecții laterale și laterale, tomografie a zonei afectate;

2) Un test de sânge vă permite să identificați anumite modificări. Cu tuberculoză activă, adesea există o combinație de anemie și limfopenie, cu tuberculoză complicată - leucocitoză, schimbare la stânga, monocitoză, rată de sedimentare a eritrocitelor accelerate.

3) Analiza urinei. Modificările din analize nu sunt specifice, dar în combinație cu alte semne confirmă activitatea procesului de tuberculoză.

4) Examinarea sputei, frotiu din partea din spate a faringelui pentru a detecta biroul se face de cel puțin 3 ori în decurs de 3 zile;

5) Diagnostic individual de tuberculină (testul de zgâriere a pielii, test Mantoux cu diluții tuberculine, test Koch în spital) - în funcție de indicații.

Sunt 2 criteriile patognomonice    tuberculos:

I. Agentul cauzator de tuberculoză este tuberculoza microbacteriană (MBT).

Detectarea MBT în material de la pacient indică specificitatea procesului patologic în corpul pacientului.

Alegerea materialului pentru studiu depinde de forma clinică a tuberculozei, de faza procesului de tuberculoză, de vârsta pacientului. Cel mai frecvent studiat spută, apă de spălare a bronhiilor și a stomacului, fecale, urină, biopsie și material chirurgical, exudat pleural, etc.

Aplicați următoarele metode de cercetare microbiologică:

1) Metoda bacteriostopică :

Examenul bacterioscopic este cea mai rapidă, mai ușoară și mai ieftină metodă de detectare a micobacteriilor rezistente la acid. Cu toate acestea, metoda bacterioscopică permite detectarea micobacteriilor cu un conținut de nu mai puțin de 5000-10000 pentru 1 ml din materialul studiat. Detectarea microscopică a micobacteriilor rezistente la acid previne diferențierea patogenului de tuberculoză de micobacterii atipice și saprofite.

2) Metoda culturii (însămânțarea pe medii nutritive) permite detectarea MBT în prezența a câteva zeci de celule microbiene în 1 ml din materialul de testare.

Cu toate acestea, creșterea culturii biroului pe un mediu nutritiv solid apare o perioadă lungă de timp - 2-3 luni. În prezent, au fost obținute medii nutritive lichide, în care MBT crește în decurs de 10-14 zile. O importanță deosebită este evaluarea cantitativă a contaminării materialului studiat, care ne permite să estimăm gravitatea procesului, prognosticul său și să determinăm metodele de tratament. Metoda culturală permite diferențierea MBT de alte tipuri de micobacterii și determinarea susceptibilității / rezistenței medicamentoase a Oficiului la medicamentele împotriva tuberculozei.

3) Metoda biologică - infecție a animalelor de laborator (în special cobai sensibili). Metoda este extrem de sensibilă, deoarece vă permite obținerea unui rezultat pozitiv dacă materialul studiat conține chiar micobacterii unice (1-5). Durata studiului este de 1,5-2 luni. Această metodă poate fi utilizată numai în laboratoarele institutelor de cercetare federale.

Fiecare dintre metodele utilizate are propria sa metodă fețe pozitive   și anumite restricții.

Diagnosticul suplimentar și testele de diagnostic diferențial pentru tuberculoză sunt studii imunologice și metode biologice moleculare. Aceste metode vă permit să identificați agentul cauzator de tuberculoză, reducând în același timp viabilitatea acestuia. Metodele imunologice permit evaluarea reactivității pacientului, identificarea activității procesului tuberculos, monitorizarea eficacității tratamentului, determinarea necesității tratamentului chirurgical, prezicerea dinamicii ulterioare a unui proces specific.

§ determinarea antigenelor MBT și a anticorpilor la agentul cauzal de tuberculoză prin testul imunologic enzimatic (ELISA);

§ determinarea ADN-ului tuberculozei mycobacterium prin reacția în lanț a polimerazei (PCR).

II . Elementele de granulom tuberculos,   detectate prin metode histocitologice în materialul studiat.

O reacție inflamatorie protectoare este formată în jurul focarului necrozei cauzate de MBT: un arbore de celule epiteliale, celule gigante Pirogov-Langhans, o acumulare de limfocite.

Posibilitatea cercetării morfologice este asociată cu anumite dificultăți, deoarece în diverse cazuri clinice de tuberculoză la copii, materialul patologic pentru cercetare poate să nu fie disponibil.

Prin urmare, pentru diagnosticarea precoce și corectă a bolii la copii, evaluarea unui complex de date de laborator cu raze X joacă un rol major.

Principalele metode de detectare a tuberculozei la copii și adolescenți

În prezent, detectarea tuberculozei la copii și adolescenți este posibilă prin următoarele metode:

oDiagnosticul de tuberculină în masă . Un test Mantoux cu 2 Tu PPD-L este utilizat ca test de screening în masă.

Diagnosticul de tuberculină în masă vizează:

Detectarea precoce a tuberculozei la copii și adolescenți;

Studiul infecției Oficiului și riscul anual de infecție primară.

Testele de tuberculină nu permit evaluarea intensității imunității anti-tuberculozei.

La consultarea ftihiatrului îi trimit copiii grupuri de risc    privind dezvoltarea tuberculozei. Grupurile de risc includ:

1. Pentru prima dată infectate de birou. Faptul de infecție primară este stabilit prin "întoarcerea" reacției tuberculinei.

2. Persoanele infectate cu sensibilitate hiperergică la tuberculină, care este determinată de mărimea infiltratului de 17 mm sau mai mult, prezența reacțiilor necrozante veziculoase la locul administrării intradermice de tuberculină.

3. Persoanele infectate cu o creștere a sensibilității la tuberculină. Creșterea sensibilității la tuberculină se determină prin creșterea dimensiunii infiltratului cu 6 mm sau mai mult față de anul precedent.

4. Persoanele cu etiologie neclară a alergiei la tuberculină - dacă în acest moment nu este posibilă rezolvarea problemei cauzei unei reacții pozitive la tuberculină (post-vaccin? Infecțioasă?). Nu există criterii absolute pentru diagnosticul diferențial al alergiilor post-vaccinare și tuberculinelor infecțioase. Adesea, problema naturii reacției este rezolvată de un ftihiatru în observație dinamică. Pe lângă mărimea infiltratului, se ia în considerare și aprecierea caracteristicilor sale de calitate: intensitatea culorii, claritatea contururilor, perioada de conservare a pigmentării după dispariția infiltratului.

5. Persoanele infectate de birou dacă testul Mantoux cu 2 Tu PPD-L a fost efectuat neregulat. În acest grup, o atenție deosebită trebuie acordată copiilor și adolescenților frecvent bolnavi și celor care suferă de boli concomitente.

oExaminarea în timp util a copiilor aflați în contact cu pacientul tuberculoza.

O atenție deosebită trebuie acordată identificării sursei de infectare a copiilor cu Mycobacterium tuberculosis. Modalitățile de infectare la copii și adolescenți depind de natura sursei de infecție.

1. Calea aerogenă este contactul cu o persoană care suferă de tuberculoză, în special bacterioplastică. În acest caz, se produce o infecție.M. tuberculoza.

2. Calea alimentară este utilizarea laptelui infectat și a produselor lactate netratate termic de la animalele care suferă de tuberculoză. Infecția M. se produce.bovis.

3. Calea de contact - când MBT penetrează prin pielea și mucoasele deteriorate, se produce leziunea primară locală a acestor organe.

4. Calea transplacentară este rară. Un rol important îl joacă afectarea placentei - atât tuberculoza, cât și vătămarea la naștere. MBT pătrunde prin vena ombilicală în făt, se află în principal în ficat, afectând eventual ganglionii limfatici portal. O leziune primară poate apărea în plămâni și în alte organe în timpul aspirației și ingestiei unui lichid amniotic infectat.

În majoritatea cazurilor, copiii, în special cei de vârstă precoce și preșcolară, sunt infectați cu OIM în familie. Pericolul unei vetre de familie de infectare cu tuberculoză este cauzată nu numai de masivitatea însămânțării, ci și de durata acesteia. Având un copil din primele luni de viață în contact cu o tuberculoză bolnavă în cele mai multe cazuri duce la dezvoltarea bolii. De regulă, în aceste cazuri, copiii dezvoltă forme generalizate, complicate de tuberculoză.

Dacă un pacient cu tuberculoză este identificat în familie, contactul este deconectat imediat. Copilul este trimis pentru consultație medicului ftihiatru pentru examinare în decurs de 7-10 zile (ODM). Pentru copii, cea mai importantă măsură preventivă este de a preveni contactul cu un pacient cu tuberculoză.

oExaminarea atunci când se ocupă de simptomele bolii.

Manifestările inițiale ale procesului tuberculos sunt limitate: pierderea poftei de mâncare, greutatea corporală, oboseala, iritabilitatea, ocazional creșterea temperaturii până la numerele subfungiale etc.

Copiii mici devin chinuitori, capricios, dormind neliniștitor. La copiii din această grupă de vârstă, apetitul și scăderea în greutate sunt deosebit de vizibile.

copii vârstă preșcolară   obosit repede în timpul jocurilor, există transpirații, ocazional - simptome dispeptice, dureri abdominale.

Reducerea performanțelor școlare, a memoriei și a atenției scade. Copiii se plâng de oboseală, dureri de cap frecvente și, uneori, durerile care trec rapid în mușchi și articulații.

Simptomele de intoxicare reflectă tulburări ale sistemului nervos cauzate de efectele toxice asupra sistemului nervos al Mycobacterium tuberculosis.

Schimbarea temperaturii la copiii cu tuberculoză este foarte diversă. Cel mai adesea este subfebrilă. În același timp, tuberculoza activă poate apărea cu o temperatură normală sau febrilă. Uneori există fluctuații semnificative ale temperaturii dimineața și seara.

Tusea apare cu un curs complicat de tuberculoză la copii. La debutul bolii, tusea nu este simptomul principal.

Se observă manifestări clinice puternice ale bolii la pacienții cu forme comune și cu un curs complicat de tuberculoză. Dar simptomele patognomonice clinice ale tuberculozei nu există. Prin urmare, diagnosticarea în timp util a procesului de tuberculoză este posibilă numai cu o evaluare cuprinzătoare a datelor anamnestice, a datelor din cercetarea obiectivă, diagnosticul de tuberculină, datele din metodele de cercetare instrumentală și de laborator.

oExaminare fluorografică profilactică.

Examinările medicale preventive fluorografice sunt efectuate de adolescenți în vârstă de 15 și 17 ani. În absența datelor privind examinările preventive la aceste vârste, se efectuează o examinare fluorografică extraordinară.

Dacă se constată modificări pe fotofluorogramă, pacientul este examinat temeinic de un ftihiatru. Pentru a face acest lucru, utilizați minimul de diagnosticare obligatorie (ODM).

Caracteristicile cursului de tuberculoză la copiii mici

determinată de reactivitatea și rezistența corpului copilului, precum și de caracteristicile sale anatomice și fiziologice.

Mecanisme de rezistență naturală   nou-născutul se află într-o stare de deficiență fiziologică. Nou-nascuti marcate:

- activitate scăzută fagocitară a leucocitelor;

Activitate scăzută de migrare a celulelor mononucleare și a leucocitelor. Motivul pentru aceasta este formarea redusă a factorilor chemotactici serici și o eliberare crescută a factorului inhibitor prin limfocitele din sânge. Acești factori sunt legați de capacitatea ușoară a pielii noilor născuți de a dezvolta un răspuns inflamator;

- faza de absorbție a fagocitoză este bine definită, faza digestivă se situează cu mult în urma fazei de absorbție;

- lipsa factorilor umorali ai rezistenței naturale. Factorii umorali ai rezistenței naturale (complement, lizozim, properdin etc.) duc la distrugerea extracelulară a micobacteriilor. Deficiența principalelor componente ale complementului (C3 și C5) contribuie la formarea insuficientă a factorilor chemotactici în ser și la activitatea bactericidă insuficientă. Lizozima are proprietatea de a lăsa bacteriile. Nivelul său în serul de nou-născuți este mai mare decât la adulți, dar după 7 zile scade până la nivelul din serul mamei. Activitatea bactericidă a activității se manifestă numai în combinație cu ioni de complement și magneziu.

Factorii de protecție nespecifici joacă rolul principal de protecție până în perioada de maturare a mecanismelor imunitare specifice.

Formarea reactivității imunologice corpul copilului are loc la momente diferite:

- imaturitatea funcțională a sistemelor de limfocite T și B. Funcționarea limfocitelor T începe la făt cu vârste cuprinse între 9 și 15 săptămâni, dar reacțiile de hipersensibilitate de tip întârziat ating dezvoltarea completă până la sfârșitul primului an de viață. Astfel, limfocitele T ale fătului și ale nou-născutului nu sunt îndeajuns de mature. Numărul de limfocite B la nou-născuți este apropiat de valoarea la adulți, dar producția de anticorpi este minimă sau absentă. Funcționarea limfocitelor B începe și se îmbunătățește în continuare în perioada postnatală. Când infecția intrauterină are loc la educațieIgM   celulele fetale. În serul de nou-născuți lipseșteIgA , cantitatea sa crește până la sfârșitul unui an de viață și atinge nivelul adulților cu numai 8-15 ani.IgG   la un copil nou-născut, este matern, iar în primele 6 luni de viață a copilului, are loc catabolismul și scăderea nivelului.IgG   apare doar la a 6-a săptămână de viață a copilului, iar numărul acestuia crește cu vârsta de 5-15 ani. Astfel, un nou-născut este incapabil să primească un răspuns umoral specific.

Copilul nou-născut are o deficiență în funcțiile sistemelor T și B ale limfocitelor, o scădere a rezistenței nespecifice. Acești factori joacă un rol în modelarea mecanismelor de imunitate la tuberculoză. Infecția cu tuberculoză, la rândul său, cu dezvoltarea bolii schimbă funcționarea sistemului imunitar.

La copiii prematuri, există o lipsă considerabilă de factori de rezistență naturală. Imunodeficiența în perioada prematurității este lungă și durează până la 5 ani de viață.

Cursul advers al infecției cu tuberculoză este favorizat de particularitățile organelor respiratorii la copiii mici, datorită structura anatomică și fiziologică:

- îngustarea relativă, mărimea mică și diferențierea funcțională insuficientă a sistemului de conducere a aerului conduc la o deteriorare a ventilației plămânilor și contribuie la sedimentarea microorganismelor;

- caracteristicile sistemului limfatic;

- un număr insuficient de glande mucoase în mucoasa bronșică, ceea ce duce la uscarea relativă a acesteia și face dificilă evacuarea substanțelor străine, inclusiv a microorganismelor;

- acini are o structură primitivă, slabă în fibre elastice, care reduce debitul de aer și favorizează sedimentarea microorganismelor;

- o cantitate insuficientă de agent tensioactiv creează condiții pentru dezvoltarea unor modificări inflamatorii specifice și nespecifice în plămâni, contribuie la dezvoltarea atelectazelor;

Consecința acestor trăsături la copiii mici este o leziune masivă a țesutului limfoid, o tendință de generalizare a procesului tuberculos, tendința de a produce necroza cauzală în organele afectate.

Caracteristicile cursului de tuberculoză în adolescență   sunt determinate de:

- activitate sporită a proceselor metabolice, ceea ce duce la o imagine pronunțată a cursului morfologic și clinic al procesului tuberculozei;

- maturarea neuniformă a organelor și sistemelor individuale, care poate determina selectivitatea localizării leziunii;

- dezvoltarea rapidă și restructurarea sistemului neuroendocrin: la adolescenți, funcția glandei tiroide, glandele sexuale este sporită, raportul dintre procesele de excitație și inhibiția în sistemul nervos    (predominarea procesului de excitație).

Acești factori afectează capacitățile de protecție și adaptare ale corpului unui adolescent, natura cursului imunologic, reacțiile inflamatorii și regenerarea și, în consecință, manifestările clinice și rezultatele bolii.

La pacienții cu tuberculoză, modificările testului general de sânge nu sunt patognomonice. Cu forme limitate și inactive de tuberculoză, hipocromia eritrocitelor este tipică pentru numărul lor normal. Cu infiltraturi masive sau pneumonie cazoasă, cu limfadenită cauzală larg răspândită, leziuni intestinale specifice, precum și cu sângerări pulmonare sau postoperatorii mari, eritropenie și microcitoze, oligochromasie, policromasie. Macrocitoza și chiar mai mult, poikilocitoza este mult mai puțin frecventă, de obicei cu anemie severă. Numărul de reticulocite cu o fază compensată de tuberculoză variază de la 0,1 la 0,6%, cu subcompensate - de la 0,6 la 1,0%, iar 1% din reticulocite sunt caracteristice decompensate.

Când tuberculoza, în unele cazuri, poate exista o leucocitoza moderată (de până la 15 mii de leucocite.), Mai puține radiații, care apar la 2-7% dintre pacienții cu forme care apar procese limitate și ușor și la 12,5% - de tuberculoză pulmonară distructive și progresivă .

Cel mai adesea, schimbările apar în formula leucocitelor. Se observă atât neutrofilia relativă, cât și absolută, trecerea leucocitelor moderate spre stânga la promieielocite. Mielocitele sunt foarte rar întâlnite în cazul tuberculozei necomplicate. Creșterea numărului de neutrofile cu grilă patologică în hemograma unui pacient cu tuberculoză indică întotdeauna durata procesului: la pacienții cu tuberculoză severă, aproape toate neutrofilele conțin granule patologice. Când se declanșează o epidemie tuberculoasă, schimbarea nucleară ajunge la normalitate relativ repede. Granularitatea anormală a neutrofilelor durează de obicei mai mult decât alte modificări ale hemogramei.

Cele mai multe forme de tuberculoză primară sunt însoțite de limfopenie, care se observă uneori de mai mulți ani chiar și după modificări specifice cicatricilor. Tuberculoza secundară în faza acută, în funcție de gravitatea procesului, poate fi însoțită fie de un număr normal de limfocite, fie de limfopenie.

Printre testele de evaluare a procesului tuberculos, un loc special este ocupat de determinarea ratei de sedimentare a eritrocitelor (ESR), care este importantă în evaluarea cursului procesului de tuberculoză și identificarea formelor sale active. O creștere a ESR indică prezența unui proces patologic (infecțio-inflamator, purulent, septic, hemoblastoză, boala lui Hodgkin etc.) și servește ca indicator al severității acestuia, însă indicatorii normali ai ESR nu indică întotdeauna absența patologiei. Eliminarea sedimentelor de tip eritrocitare este accelerată de creșterea conținutului de sânge al globulinelor, fibrinogenului, colesterolului și scăderea vâscozității sângelui. Estimarea lentă a eritrocitelor este caracteristică condițiilor care implică hemoconcentrația, o creștere a albuminei și a acizilor biliari.

Hemograma la pacienții cu modificări ale tuberculozei în timpul tratamentului. Modificările hematologice dispar cu atât mai repede, cu cât este mai eficientă intervenția terapeutică. Cu toate acestea, trebuie avut în vedere efectul hematopoiezei diferitelor medicamente antibacteriene. Acestea produc adesea eozinofilie, în unele cazuri - leucocitoză și, de cele mai multe ori, leucopenie până la agranulocitoză și reacție limfoid-reticulară. Controlul sistematic hematologic și analiza corectă a datelor obținute sunt esențiale pentru evaluarea stării clinice a pacientului, a dinamicii procesului și a eficacității tratamentului aplicat.

Analiza urinei

În cazul tuberculozei sistemului urinar, testarea urinei este principala metodă de diagnosticare în laborator. Se observă leucocitriu, eritrocituria, proteinurie, hipoisosterenurie, micobacterie tuberculoasă, bacteriurie nespecifică.

Leucocitare este cel mai frecvent simptom al tuberculozei sistemului urinar înainte de chimioterapie specifică și este absent numai în cazuri excepționale, de exemplu, cu o eliminare completă a lumenului ureterului. Testul Nechiporenko (determinarea numărului de leucocite în 1 ml de urină) ajută la evaluarea mai obiectivă a gradului de leucocitrioză în nefrotuberculoză și, în unele cazuri, la identificarea acesteia în cadrul analizei normale a urinei. Cu toate acestea, trebuie avut în vedere faptul că leucocitouria poate fi în pielonefrită acută și cronică, cistită, uretră, pietre la rinichi și uretere.

Eritrotsiturii. ca leucocituria. Este considerat unul dintre cele mai frecvente semne de laborator de tuberculoză a sistemului genito-urinar. Frecvența hematuriei depinde de prevalența procesului, crește odată cu dezvoltarea procesului tuberculos distructiv în rinichi. Eritrocituria fără leucocitrie este mai caracteristică pentru stadiile incipiente ale tuberculozei rinichilor. Hematuria, predominând peste leucocitrie, este un argument important în favoarea tuberculozei rinichilor în diferențierea sa cu pielonefrită nespecifică.

Test de sânge biochimic

În tuberculoză, schimbările în parametrii biochimici depind în primul rând de faza procesului, complicații și diverse boli asociate. La pacienții cu tuberculoză inactivă a plămânilor și a altor organe, fracțiunile proteice și proteine ​​totale din serul de sânge nu se modifică și se determină conținutul lor normal.

În formele acute ale bolii, precum și în exacerbarea și progresia formelor cronice de tuberculoză, coeficientul de albumină-globulină scade.

Esențială pentru evaluarea stării funcționale și a afectării organice a ficatului în tuberculoză și a complicațiilor sale este determinarea în ser a bilirubinei directe și totale, a aspartat aminotransferazei (ACT), a alanin aminotransferazei (ALT). Determinarea dinamică a nivelului de aminotransferaze. bilirubina în tratamentul pacienților cu tuberculoză, în special în formele sale severe, este o componentă obligatorie a examinării biochimice a pacienților cu tuberculoză și este efectuată lunar.

Evaluarea stării funcționale a rinichilor include determinarea creatininei serice și calcularea ratei de filtrare glomerulară utilizând formula Cockroft-Gault. Calcularea ratei de filtrare glomerulară utilizând testul Reberg oferă rezultate mai puțin precise.

Scopul principal al studiilor biochimice dinamice ale pacienților cu tuberculoză este de a controla cursul procesului, de a identifica în timp util efectele secundare ale medicamentelor și de corectarea adecvată a tulburărilor de homeostază rezultate.

Utilizarea metodelor de cercetare biochimică pentru tuberculoza extrapulmonară

Indicatorul cel mai informativ ia în considerare conținutul de acid tuberculostearic în fluide biologice, dar definiția sa este plină de dificultăți tehnice (nevoia de a utiliza cromatografia de gaz și spectrometria de masă).

Promit să măsoare activitatea adenozin deaminazei, o enzimă detectată în fluide: sinovial, pericardial, ascitic sau cerebrospinal. Principalii producători de adenozin deaminază sunt limfocitele și monocitele. Determinarea activității adenozin deaminazei în fluide biologice facilitează diagnosticul de sinovită tuberculoasă, tuberculoza ganglionilor limfatici, meningita tuberculoasă, serozita tuberculoasă.

Unii parametri biochimici datorită nespecificității lor sunt determinați numai în fluide biologice apropiate de leziune. Nivelul indicatorilor este măsurat ca răspuns la administrarea subcutanată sau intracutanată a tuberculinei (de obicei înainte de administrare și 48 și 72 de ore după aceasta). După aceea se calculează gradul de creștere a nivelului markerului (în%) față de nivelul inițial.

Determinarea optimă în urină a activității unei enzime transmidinază specifice unei organe, a cărei apariție este observată cu leziuni renale de natură diferită. Studiul transaminidazei este justificat numai în condițiile administrării subcutanate a tuberculinei pentru a exacerba procesul inflamator local. Activitatea transamidinazei în urină este determinată la momentul inițial și 24-72 ore după administrarea a 50 TE de tuberculină. O creștere a fermenturii de 2 ori sau mai mult permite în 82% din cazuri diferențierea tuberculozei active a rinichilor de exacerbarea pielonefritei cronice.

În cazul tuberculozei genitale feminine, concentrațiile de haptoglobină și malondialdehidă din sânge sunt determinate în testul de tuberculină provocator. Tuberculina se administrează subcutanat la o doză de 50 TE și, după 72 de ore, se efectuează un studiu biochimic repetat. În cazul etiologiei tuberculoase, gradul de creștere a nivelului de haptoglobină este de cel puțin 28%, iar nivelul malondialdehidei - 39% sau mai mult. De asemenea, utilizat pentru a determina activitatea adenozin deaminazei în lichidul peritoneal derivat din spațiul Douglas. Punctul este reexaminat 72 de ore după administrarea intradermică a tuberculinei în doze de 0,1 TE și 0,01 TE în zona de proiecție a organelor genitale interne pe peretele abdominal anterior. În favoarea procesului tuberculos, o creștere a activității adenozin deaminazei cu 10% sau mai mult față de cea inițială este orientativă.

Cu afectarea ochilor, este examinată o reacție focală care apare în ochi ca răspuns la stimularea antigenică. În același timp, dezvoltarea nedorită a unui răspuns pronunțat, însoțită de o scădere a funcțiilor vizuale. Deoarece evaluarea reacțiilor focale minime este adesea dificilă, pentru a obiectiviza concluzia, se recomandă concentrarea în paralel asupra gradului de creștere a haptoglobinei serice sau a adenozin deaminazei serice.

Toate studiile biochimice trebuie efectuate împreună cu alte metode.

Testul de coagulare a sângelui

Relevanța stării de cercetare a sistemului de coagulare a sângelui de TBC este cauzată de prezența unui număr de pacienți cu hemoptizie tuberculoză pulmonară sau hemoragie pulmonară, precum și complicațiile hemocoagulation în tratamentul chirurgical al tuberculozei. În plus, hemocoagularea intravasculară latentă, care este asociată în mod natural cu tuberculoza, afectează evoluția bolii și eficacitatea chimioterapiei.

La pacienții cu tuberculoză pulmonară, cu predominanța componentei exudative a inflamației, se observă o scădere a activității anticoagulante a sângelui. La pacienții cu o prevalență scăzută a unei leziuni specifice în plămâni, cu predominanța componentei productive a inflamației, hemocoagularea intravasculară nu este foarte pronunțată. La pacienții cu tuberculoză pulmonară cu hemoptizie și sistemul pulmonar de coagulare a sângelui de stat hemoragie este diferită: la pacienții cu pierderi mici de sânge la gemoptoe înălțime sau imediat după terminarea ei există o creștere bruscă a capacității de coagulare a sângelui, datorită intensificării severă a trombinoobrazovaniya menținând în același timp a crescut „structurale“ de coagulare. La pacienții cu pierdere masivă de sânge, se observă o scădere a potențialului de coagulare datorită scăderii concentrației de fibrinogen. activitatea factorului XIII, numărul de trombocite. În stadiul tratamentului chirurgical la pacienții cu forme limitate de tuberculoză pulmonară, nu există tulburări semnificative cu sistemul homeostaziei. Pacienții cu procese obișnuite la efectuarea pneumonimului sau a pleuropneumonectomiei dezvoltă adesea DIC, care poate lua forma unei "a doua boli".

Pentru a monitoriza starea sistemului de coagulare a sângelui la pacienții cu tuberculoză pulmonară, este necesar să se determine timpul de tromboplastină parțială activată (APTT), fibrinogenul, timpul de trombină, indicele de protrombină, precum și timpul de sângerare și timpul de coagulare a sângelui.

Studii hormonale

Observațiile experimentale și clinice moderne indică prezența schimbărilor în starea hormonală în pneumonia pulmonară specifică. Se demonstrează că corectarea disfuncției sistemelor hipofizo-suprarenale, hipofizare-tiroidiană și a funcției pancreatice, în combinație cu terapia anti-tuberculoză, contribuie la activarea proceselor de fibrogenesis și reparații în focalizarea unei inflamații specifice.

Statutul funcțional al sistemului pituitar-tiroidian este evaluat prin conținutul seric de triiodotironină (T3), tiroxină (T4), hormon de stimulare a tiroidei a hipofizei (TSH). Sa constatat că hipotiroidismul subclinic este detectat la 38-45% dintre pacienții cu tuberculoză pulmonară și este cel mai adesea diagnosticat în forme diseminate și cavernoase fibroase ale procesului. Cu aceleași forme, nivelurile T3 și T4 sunt cel mai reduse și un dezechilibru al acestor hormoni apare sub forma unei creșteri a raportului T 4 / T h.

Funcția cortexului suprarenale este evaluată prin nivelul cortizolului din serul sanguin și prin funcția endocrină a pancreasului prin concentrația de insulină imunoreactivă. În faza acută a unei boli infecțioase, necesitatea cortizolului endogen și a insulinei crește. Hiperinsulinemia indică, de asemenea, rezistența la insulină a țesuturilor corporale, caracteristică oricărui proces inflamator activ, în special specific. Determinarea funcției glucocorticoide a glandelor suprarenale cu tuberculoză pulmonară activă evidențiază prezența hipercorticismului la majoritatea pacienților. Indicatorii normali ai concentrației de cortizol din sânge la un pacient cu inflamație infecțioasă în perioada acută trebuie considerați ca o insuficiență relativă a funcției glucocorticoide a cortexului suprarenale, care poate servi drept bază pentru terapia de substituție cu doze adecvate de glucocorticoizi.

Aproape o treime din pacienții cu tuberculoză pulmonară pot fi determinați că nivelul lor de insulină-lime este destul de scăzut și se apropie de limita inferioară a normalului, în timp ce 13-20% consideră hiperinsulinismul semnificativ. Ambele hipo-și hiperinsulinismul relativ sunt factori de risc înalt pentru dezvoltarea tulburărilor de metabolism al carbohidraților cu o severitate variabilă. Aceste schimbări în activitatea funcțională a celulelor B pancreatice necesită un control glicemic regulat la pacienții cu tuberculoză și prevenirea în timp util a diabetului zaharat. În plus. acest lucru servește ca o justificare suplimentară pentru utilizarea dozelor fiziologice de insulină în terapie complexă   tuberculoza.

În general, scăderea nivelurilor hormonului tiroidian, dezechilibrul lor, hipercortisolemia și hiperinsulinismul sunt cele mai pronunțate la pacienții cu maree mare   tubercular, cu leziuni pulmonare extinse și simptome severe de intoxicație tuberculoasă.

Diagnosticul microbiologic al tuberculozei

Sunt necesare studii microbiologice pentru identificarea pacienților cu tuberculoză, verificarea diagnosticului, monitorizarea și corectarea chimioterapiei, evaluarea rezultatelor tratamentului, cu alte cuvinte, de la momentul înregistrării unui pacient cu tuberculoză până la scoaterea din registru.

Toate programele și proiectele epidemiologice se bazează pe o evaluare a numărului de excremente de bacterii care nu pot fi efectuate fără a utiliza metode de laborator pentru detectarea tuberculozei mycobacterium. Atunci când se examinează negocabilitatea așa-numitei populații neorganizate, procentul excrețiilor de bacterii atinge 70 sau mai mult, ceea ce face ca metodele de laborator să fie suficient de remediu eficient   identificarea pacienților cu tuberculoză în rândul acestei populații.

Metode tradiționale microbiologice pentru diagnosticarea tuberculozei - studii bacterioscopice și de cultură. Metodele moderne iau în considerare cultivarea tuberculozei mycobacterium în sisteme automate, PCR. Cu toate acestea, toate aceste metode sunt în mod necesar combinate cu metode bacteriologice clasice.

Colectarea materialului de diagnosticare

Eficacitatea studiilor de laborator depinde în mare măsură de calitatea materialului de diagnosticare. Respectarea regulilor pentru colectarea, stocarea și transportul materialelor de diagnostic și implementarea exactă a algoritmului de examinare a pacienților afectează în mod direct rezultatul și asigură siguranța biologică.

Pentru cercetarea tuberculozei folosind o varietate de materiale. Datorită faptului că TB logkih- forma cea mai comuna leziuni tuberculoase, materialul de bază pentru cercetarea considera spută și alte tipuri de traheobronșic detașabile: superior secrețiilor tractului respirator obținute după inhalarea de aerosoli: spălările bronhice; bronșicile bronhoalveolare; material obținut prin bronhoscopie, biopsie transtraheală și intrapulmonară: aspirație bronșică, frotiuri laringiane, exsudate, frotiuri ale rănilor etc.

Eficacitatea cercetărilor crește dacă efectuează o colecție controlată de material de la pacient. Pentru a face acest lucru, alocați o cameră special echipată sau cumpărați cabine speciale. Materialul de colectare este o procedură periculoasă, deci trebuie să colectați materiale pentru cercetare, respectând regulile de siguranță infecțioasă.

Materialul pentru cercetarea tuberculozei mycobacterium este colectat în flacoane sterile cu capace bine înșurubate pentru a preveni contaminarea mediului și pentru a proteja materialul colectat de contaminare.

Flacoanele pentru colectarea materialului de diagnosticare trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:

• trebuie să fie realizate din material rezistent la impact;
• ar trebui să se topească ușor în timpul autoclavării;
• să aibă un volum suficient (40-50 ml):
• au o deschidere largă a sputei (diametrul nu mai mic de 30 mm);
• să fie ușor de utilizat, transparent sau translucid, astfel încât să puteți evalua cantitatea și calitatea probei colectate fără a deschide capacul.

Pentru obținerea rezultatelor optime de cercetare, trebuie îndeplinite următoarele condiții:

• colectarea de materiale este efectuată înainte de începerea chimioterapiei;
• materialul pentru studiu trebuie colectat înainte de consumul de mâncare și de droguri dimineața;
• pentru cercetare este de dorit să se colecteze cel puțin 3 probe de spută dimineața. Strângeți sputa timp de 3 zile consecutive;
• materialul colectat trebuie livrat la laborator cât mai curând posibil:
• în cazul în care este imposibil să se livreze imediat laboratorul, se depozitează la frigider la o temperatură a aerului de 4 ° C timp de cel mult 48 de ore;
• la transportul materialului, este necesar să se monitorizeze cu atenție integritatea flacoanelor.

Sputa colectată corect are un caracter mucus sau mucopurulent. Volumul optim al porțiunii investigate a sputei este de 3-5 ml.

Flegmul este colectat sub supravegherea unui medic. Persoanele responsabile pentru colectarea sputei, este necesar să se monitorizeze punerea în aplicare a anumitor reguli:

• este necesar să se explice pacientului scopul studiului și necesitatea de a tuse nu saliva sau mucusul nazofaringian, ci conținutul tractului respirator profund. Acest lucru poate fi obținut ca urmare a tusei productive care apare după câteva (2-3) respirații adânci. De asemenea, este necesar să se avertizeze pacientul că trebuie mai întâi să-și clătească gura cu apă fiartă pentru a îndepărta partea principală a microflorei vegetative din cavitatea orală și resturile alimentare care împiedică studiul sputei;
• un lucrător medical implicat în colectarea sputei, în plus față de o haină și un capac, trebuie să poarte o mască, mănuși de cauciuc și un șorț din cauciuc;
• în spatele pacientului, se recomandă să țineți flaconul cât mai aproape de buze și să separați imediat sputa în el în timp ce tuse, în timp ce este necesar să se prevadă că fluxul de aer este îndreptat departe de furnizorul de servicii medicale:
• după finalizarea colectării sputei, medicul trebuie să închidă cu atenție flaconul cu un capac și să evalueze cantitatea și calitatea sputei colectate. Apoi, flaconul este etichetat și plasat într-un bix special pentru transportul în laborator.

În cazul în care pacientul nu produce flegma, cu o noapte înainte și dimineața devreme în ziua de colectare a materialului necesar să-i dea un expectorant :. Un extract din rădăcini de nalba (mukaltin), bromhexin, ambroxol, etc. - sau aplicați un inhalare iritanta cu ajutorul echipamentelor instalate in camera pentru a colecta spută. Materialul colectat în acest mod nu poate fi conservat și trebuie examinat în ziua colectării. În scopul de a evita "respingerea" sa în laborator în direcția ar trebui să facă un semn special.

Dacă nu se efectuează cercetări microbiologice la această instituție, materialul de diagnostic colectat trebuie livrat central la laborator, sub rezerva conservării obligatorii a materialului între livrările în frigider sau cu utilizarea de conservanți. Materialul este livrat la laborator în cutii de expediere care pot fi ușor dezinfectate. Fiecare eșantion trebuie să fie etichetat cu eticheta adecvată, iar întregul lot trebuie completat cu formularul de însoțire.

Modurile și frecvența examinării pacienților

În timpul diagnosticului inițial, așa-numitul diagnostic, de examinare a unui pacient pentru tuberculoză, este necesar să se investigheze cel puțin 3 porții de spută în 2 sau 3 zile. colectate sub supravegherea personalului medical, ceea ce sporește eficiența microscopiei.

Screening-ul tuberculozei primare trebuie efectuat de către toate instituțiile de diagnostic medical din sistemul de sănătate. Recent, pentru a crește eficacitatea examinării primare, așa-numitele centre de microscopie au fost stabilite pe baza laboratoarelor de diagnostic clinic, dotate cu microscoape moderne și echipamente pentru a asigura siguranța epidemiei.

În instalațiile TB, se utilizează o schemă de screening, care include un studiu al sputei sau al altui material de diagnostic de cel puțin 3 ori în decurs de 3 zile. În procesul de tratament, studiile microbiologice sunt efectuate în mod regulat cel puțin o dată pe lună în faza de chimioterapie intensivă. În timpul tranziției la faza de urmărire, studiile sunt efectuate mai puțin frecvent - la intervale de 2-3 luni, în timp ce multiplicitatea studiului este redusă la două.

Caracteristicile colecției de material diagnostic în tuberculoza extrapulmonară

Particularitatea materialului patologic în formele extrapulmonare de tuberculoză este o concentrație scăzută de tuberculoză micobacteriană în acesta, care necesită metode mai sensibile de cercetare microbiologică, în primul rând metodele de plantare pe un mediu nutritiv.

În tuberculoza urogenitală, urina este cel mai accesibil material de cercetare. Eșantionarea urinei trebuie efectuată de o asistentă medicală instruită.

Genitalele externe sunt spălate cu săpun și apă sau cu o soluție slabă de permanganat de potasiu. Faceți cu mare atenție deschiderea externă a uretrei. O porțiune medie a urinei de dimineață este colectată într-o fiolă sterilă: pentru bărbați - în mod natural, pentru femei - cu un cateter. Urina din pelvisul renal este colectată în tuburi sterile pentru cateterizarea unuia sau a doi rinichi, în ultimul caz - întotdeauna separat de fiecare rinichi. O cantitate mică din această urină este centrifugată, precipitatul este examinat.

La bărbați, spermatozoizi, punctate ale testiculelor, secrețiile de prostată sunt centrifugate pentru a obține sedimente. La orice localizare a unui proces specific în zona genitală la bărbați, un masaj al prostatei poate contribui la secreția unui secret care conține tuberculoza mycobacterium.

Sângele menstrual de la femei este colectat prin aspirație sau prin utilizarea unui capac Kafka. Materialul rezultat este eliberat din celulele roșii, spălându-l cu apă distilată, urmată de centrifugare. Peletul este examinat.

Descărcarea din canalul cervical al uterului este colectată în orice recipient sau capac de Kafka, adică este de dorit să se acumuleze 1-2 ml de material patologic.

Materialul obținut în timpul intervenției chirurgicale pe rinichi, organe genitale. biopsii, răzuitoare din endometru, omogenizate. Pentru a face acest lucru, este plasat într-un mortar steril și zdrobit cu atenție cu foarfece sterile. S-a adăugat nisipul de râu în suspensie rezultată într-o cantitate egală cu masa sa, după care s-au adăugat 0,5-1,0 ml soluție izotonică de clorură de sodiu și întregul s-a măcinat pentru a forma o masă pastă prin adăugarea de soluție de clorură de sodiu izotonică (4-5 ml). Apoi, masa este lăsată să se depună timp de 1-1,5 minute, supernatantul este examinat.

Tuberculoza oaselor și articulațiilor. Punctul (pus de abscesul abcesului), obținut cu o seringă sterilă, este plasat într-un recipient steril și este livrat imediat la laborator. Pipete sterile, pre-umezite cu soluție sterilă de clorură de sodiu, luați 2-5 ml de puroi, transferați-o în sticlă cu bile și adăugați încă 2-3 ml soluție izotonică de clorură de sodiu. Sticla este închisă cu un dop și este agitată în aparatul de glumă timp de 8-10 minute. Suspensia omogenizată este examinată.

Pentru formele fistuloase de tuberculoză osteo-articulară, puroul este luat din fistulă. Descărcarea abundentă este colectată direct într-un tub de testare. În cazurile de descărcare ușoară a puroiului, cursul fistulos este spălat cu soluție sterilă de clorură de sodiu, iar apele de spălare colectate într-un tub de testare sau o bucată de tampon înmuiată în puroi sunt trimise la studiu.

Materialul chirurgical obținut în timpul intervenției chirurgicale pe oase și articulații poate consta din mase purulent-necrotice, granule, cicatrice, țesut osos, țesut al membranelor sinoviale și alte substraturi. Se prelucrează ca și în cazul tuberculozei rinichilor.

Examinarea microbiologică a fluidului sinovial într-o soluție 3% de citrat de sodiu (raport 1: 1) pentru a preveni coagularea se efectuează imediat după puncție.

Tuberculoza ganglionilor limfatici. Se examinează și puroul extras în timpul puncției ganglionilor limfatici. ca puroi de abcese intestinale. Cheagurile nodului limfatic obținute în timpul intervențiilor chirurgicale, biopsii, sunt examinate ca și în cazul altor forme de tuberculoză.

Studiul masei fecale pentru tuberculoza mycobacterium este extrem de rar datorită absenței aproape totale a rezultatelor pozitive.

Micobacterii de microscopie

Microscopia cu spută este o metodă relativ rapidă, simplă și ieftină, care ar trebui utilizată în toate cazurile de tuberculoză suspectată. În plus, acest studiu este realizat pentru a evalua eficacitatea chimioterapiei și pentru a stabili o recuperare sau un rezultat al tratamentului fără succes în absența rezultatelor culturii.

Utilizați 2 metode de examinare microscopică:

• metoda directă de microscopie, atunci când un preparat este preparat direct dintr-un material de diagnosticare;
• metoda de microscopie a sedimentelor preparată din material decontaminat pentru cultură.

Prima metodă este utilizată în laboratoare unde se efectuează doar examinări microscopice (laboratoare de diagnostic clinic ale rețelei medicale generale).

Cele mai bune rezultate de examinare microscopică sunt obținute prin concentrarea materialului de diagnosticare (de exemplu, prin centrifugare).

Pentru a detecta tuberculoza mycobacterium cu 50% șansă de microscopie, 1 ml de spută ar trebui să conțină mai mult de 5.000 de celule microbiene. Flegma pacienților cu tuberculoză pulmonară conține de obicei o cantitate semnificativă de bacterii rezistente la acizi, ceea ce le permite să le identifice în mod confident în timpul bacterioscopiei. Sensibilitatea diagnostică a acestei metode poate fi îmbunătățită prin examinarea mai multor probe de spută de la un pacient. O bacterioscopie negativă nu exclude un diagnostic de tuberculoză, deoarece sputa unor pacienți conține mai puțin micobacterii decât poate fi detectată prin microscopie. Pregătirea slabă a frotiurilor sputei poate fi, de asemenea, cauza unui examen bacterioscopic negativ.

Cea mai obișnuită metodă de detectare a micobacteriilor rezistente la acid într-un frotiu este colorarea conform lui Ziehl-Nelsen. Metoda se bazează pe penetrarea fucsinului carbolic în celula microbiană prin membrană, care include un strat lipidic de ceară, cu efect simultan al încălzirii și un efect puternic de gravare a fenolului. Decolorarea ulterioară a frotiului cu o soluție de acid sulfuric 25% sau alcool clorhidric 3% conduce la decolorarea tuturor structurilor rezistente la acizi. Elementele de frotiuri sintetice sunt colorate cu o soluție de albastru de metilen 0,3%. Mycobacteria nu percepe coloranții obișnuiți de anilină, în urma cărora micobacteriile rezistente la acid sunt vopsite în culoarea roșu de zmeură și alți microbi și elemente celulare - în albastru.

Pentru examinarea frotiurilor colorate cu Ziehl-Nelsen, se utilizează un microscop ușor binocular cu obiectiv de imersie (mărire de 90 sau 100 de ori) și un ocular cu mărire de 7 sau 10 ori. Examinați 100 de câmpuri de vedere, care sunt suficiente pentru a identifica în microbacteriile unice de frotiu. În cazul în care rezultatul unui astfel de studiu este negativ, se recomandă să se vadă alte 200 de câmpuri de vedere pentru confirmare. Înregistrați rezultatele, indicând numărul de micobacterii rezistente la acid detectate (CUM).

În plus față de această tehnică, fluorochromii sunt utilizați pentru microscopia fluorescentă, care permite obținerea celor mai bune rezultate. Utilizarea acestei metode sporește eficiența microscopiei cu 10-15%. În cazul procesării coloranților luminescenți de tip mycobacterium (auramină, rodamină etc.), aceste substanțe sunt, de asemenea, asociate cu structuri de tip ceară ale celulei microbiene. Atunci când o celulă pictată este iradiată cu o sursă de lumină incitantă (un anumit spectru de radiații ultraviolete), ele încep să aprindă lumină roșie portocalie sau strălucitoare pe un fundal negru sau întunecat. Datorită luminozității și contrastului ridicat al imaginii vizibile, este posibil să se reducă mărirea globală a microscopului cu 4-10 ori, ceea ce extinde câmpul vizual și scade timpul de vizionare al preparatului. Odata cu aceasta, datorita unei adancimi mai mari a campului, se poate creste confortul studiului.

Când se utilizează microscopia fluorescentă, este nevoie de mult mai puțin timp pentru a vedea aceeași zonă de frotiu decât cu microscopia ușoară a frotiurilor colorate cu Tsil-Nelsen. Dacă în timpul unei zile lucrătoare microscopul arată aproximativ 20-25 astfel de frotiuri, apoi folosind microscopia fluorescentă, el poate examina mai mult de 60-80 de probe în același timp. Microscopii experimentați știu că vopsirea celulară cu un amestec de auramină și rodamină este într-un fel specifică micobacteriilor rezistente la acizi, care în acest caz au aspectul de bastoane de aur. Saprofitele sunt colorate verzui.

Un alt avantaj important al metodei de microscopie de fluorescență este capacitatea de a detecta micobacterii modificați care au pierdut sub influența unui număr de factori nefavorabili, în special chimioterapie intensivă, proprietatea rezistenței la acizi și nu sunt detectați în acest sens atunci când sunt colorați cu Tsil-Nelsen.

Dezavantajele microscopiei fluorescente includ costul relativ ridicat al microscopului și funcționarea acestuia. Cu toate acestea, în laboratoarele centralizate sau în alte laboratoare mari, în care sarcina depășește rata de 3 tehnicieni care lucrează cu trei microscoape convenționale, este mai ieftin să se utilizeze în schimb un singur microscop fluorescent.

Metodele bacteriostopice au o specificitate destul de ridicată (89-100%). Aproximativ 97% din rezultatele pozitive obținute prin orice metodă de microscopie sunt confirmate fără echivoc de rezultatele însămânțării.

Trebuie remarcat faptul că examinarea microscopică a unui frotiu dintr-un material patologic nu poate determina speciile de micobacterii rezistente la acid identificate. Metoda de microscopie face posibilă exprimarea unei opinii numai cu privire la prezența sau absența microorganismelor rezistente la acizi în preparat, ceea ce se explică prin existența în natură a unui număr mare de microorganisme rezistente la acidul tuberculozei non-tuberculoase, similare morfologic cu micobacteriile.

Evaluarea rezultatelor microscopiei produse în unități semi-cantitative.

Pentru a putea compara rezultatele diferitelor metode de microscopie, se introduc coeficienții empirici. De exemplu, pentru a compara rezultatele unui pigment colorat cu coloranți fluorescenți cu date de microscopie ușoară (mărire de 1000 de ori), este necesar să se împartă numărul de micobacterii rezistente la acid detectate de un microscop fluorescent cu un factor corespunzător la o mărire de 250 de ori a microscopului - 450 de ori - la 4, cu 630 de ori - la 2.

Caracteristicile microscopiei în tuberculoza extrapulmonară

Se efectuează microscopia directă, precum și microscopia frotiu preparată după îmbogățire, urmată de colorare Zill-Nelsen sau de coloranți luminescenți. Microscopia cu microscopie directă este ineficientă datorită concentrației scăzute de micobacterii din material și, prin urmare, este mai rațională utilizarea metodelor de îmbogățire. Centrifugarea este cea mai eficientă. Dacă materialul biologic este vâscos, se utilizează centrifugarea cu omogenizare simultană și lichefiere a materialului, care se realizează cu ajutorul centrifugilor de mare viteză cu o forță centrifugă de 3000 g și soluții de hipoclorit. Alte metode de îmbogățire, cum ar fi microflotarea, nu sunt utilizate în prezent datorită formării de aerosoli periculoși din punct de vedere biologic.

Metodă culturală pentru diagnosticarea tuberculozei

Metoda de însămânțare sau metoda de cultură este mai sensibilă decât microscopia frotiului și are o serie de avantaje față de cea din urmă. Acesta permite detectarea a cateva zeci de micobacterii viabile in materialul studiat si are o mare valoare diagnostica. Acest lucru este deosebit de important în studiul materialului de la pacienții nou diagnosticați sau tratați care secretă o mică cantitate de micobacterii.

Comparativ cu microscopia, un studiu de cultură permite creșterea numărului de pacienți identificați cu tuberculoză cu mai mult de 15-25% și, de asemenea, verificarea tuberculozei în mai multe etapele timpuriicând boala este încă bine tratabilă. Un avantaj foarte important al cercetării culturale este posibilitatea de a obține o cultură a agentului patogen, care poate fi identificată și studiată în legătură cu sensibilitatea la medicament, virulența și alte proprietăți biologice.

Dezavantajele metodelor de cultivare includ durata lor (timpul de așteptare pentru materiale atinge 10 săptămâni). costuri mai mari, complexitatea prelucrării materialului de diagnosticare.

Principii de pre-tratare a materialului de diagnosticare

Tehnicile microbiologice convenționale nu pot fi utilizate în cercetarea tuberculozei. Acest lucru se datorează faptului. că Mycobacterium tuberculosis crește foarte încet, iar majoritatea probelor de material clinic conțin microorganisme purulent și putrefactive cu creștere rapidă, ciuperci. Creșterea lor rapidă pe medii nutritive bogate împiedică dezvoltarea micobacteriilor și nu permite izolarea agentului cauzator de tuberculoză, prin urmare, înainte de însămânțare, materialul de diagnosticare trebuie să fie pretratat. În plus, micobacteriile eliberate din tractul respirator al pacientului sunt de obicei înconjurate de o cantitate mare de mucus, ceea ce face dificilă concentrarea. În acest sens, înainte de însămânțarea sputei și a altor materiale similare, este necesară lichefierea și decontaminarea acestora.

Toate detergenții și decontaminatorii au un efect toxic mai mult sau mai puțin pronunțat asupra micobacteriilor. Ca rezultat al procesării, până la 90% din micobacterii pot muri. Pentru a păstra o parte suficientă a populației micobacteriene, este necesar să se utilizeze metode de prelucrare blânde care să permită, pe de o parte, să suprime microorganismele piogene și putrefactive cu creștere rapidă și, pe de altă parte, să mențină viabilitatea micobacteriilor prezente în material.

În funcție de material, gradul de omogenitate și contaminare, se folosesc diferite decontaminante pentru tratarea precoce: pentru spută - soluție de hidroxid de sodiu 4%, soluții de fosfat de sodiu tri-substituit 10%, fosfat trisodic de clorură de benzalconiu, NALC-NaOH (N-acetil- hidroxid de sodiu) cu o concentrație finală de NaOH de 1%, pentru urină și alte materiale lichide - o soluție de acid sulfuric 3%, pentru probele contaminate, materiale care conțin grăsimi - o soluție de acid oxalic de până la 5%. În plus, în unele cazuri, utilizați enzime, surfactanți (detergenți). Utilizarea de tween și alți detergenți este însoțită de o moarte mai mică a celulelor micobacteriene (40-50% supraviețui). cu toate acestea, ele pot fi utilizate numai pentru materiale lichide. Cel mai răspândit în lume a primit NALC-NaOH. lansat în seturi. Această metodă vă permite să selectați mai mult de 85% din populația de celule micobacteriene. Decontaminarea materialelor solide care conțin țesut este mai dificilă, deoarece este dificil să se ghicească gradul de dispersie a materialului în procesul de omogenizare. De exemplu, prelucrarea probelor de biopsie a ganglionilor limfatici este adesea însoțită de o frecvență crescută a contaminării cu floră străină. În acest caz, poate fi utilizat 1% etoniu.

Materialul neomogen este omogenizat folosind sfere de sticlă în prezența decontaminantului. Materialele lichide sunt precentrifugate și se prelucrează doar sedimentele.

Tehnici de însămânțare și incubare

După pretratare, materialul este centrifugat, datorită căruia micobacteriile sunt precipitate și conținutul lor în sedimente este crescut ("îmbogățirea sedimentelor"). Precipitatul rezultat este supus neutralizării și se însămânțează cu acesta (inoculată) suprafața mediilor nutritive dense sau a eprubetelor cu medii lichide (semi-lichide). Din partea rămasă din sediment, frotiurile sunt pregătite pentru examinare microscopică. Tehnica de însămânțare ar trebui să împiedice contaminarea încrucișată a materialului de diagnosticare.

Pentru o interpretare clinică fiabilă a rezultatelor cercetărilor microbiologice, este necesar să se respecte următoarea regulă: studiile microscopice și culturale ar trebui efectuate în paralel din același eșantion de material de diagnosticare.

Tuburile inoculate sunt plasate într-un termostat la 37 o C timp de 2 zile într-o poziție orizontală. Aceasta asigură o absorbție mai uniformă a materialului în mediul nutritiv. După 2 zile, tuburile sunt plasate într-o poziție verticală și etanșate ermetic cu dopuri de cauciuc sau silicon pentru a preveni uscarea mediului de însămânțare.

Culturile se păstrează într-un termostat la 37 o C timp de 10-12 săptămâni, cu vizualizare obișnuită săptămânală. Cu fiecare vizualizare de testare, se înregistrează următorii parametri:

• termen observat vizual de la data însămânțării;
• rata de creștere (numărul de UFC);
• contaminarea plantării cu floră microbiană sau ciuperci străine (astfel de tuburi sunt îndepărtate);
• nici o creștere vizibilă. Tuburile sunt lăsate în termostat până la următoarea vizionare.

Suplimente nutritive

Pentru cultivarea micobacteriilor folosind diferite medii nutritive; dens, semi-lichid, lichid. Cu toate acestea, niciuna dintre mediile nutritive cunoscute nu are proprietăți care să asigure creșterea tuturor celulelor micobacteriene. În acest sens, pentru a îmbunătăți performanța, se recomandă utilizarea simultană a 2-3 materiale nutritive cu compoziție diferită.

Ca mediu standard pentru izolarea primară a agentului cauzal al tuberculozei și determinarea sensibilității sale la medicament, OMS recomandă mediul Lowenstein-Jensen. Acesta este un mediu ou dens pe care se obține creșterea micobacteriilor în ziua 20-25 după însămânțarea materialului bacterioscopic pozitiv. Culturile de material negativ bacterioscopic necesită o perioadă mai lungă de incubație (până la 10-12 săptămâni).

În țara noastră, distribuția propusă de E.R. Finn Ou Medie fină II. Diferă prin faptul că în loc de L-asparagină folosește glutamatul monosodic, care declanșează alte căi de sinteză a aminoacizilor din micobacterii. Creșterea apare în acest mediu puțin mai devreme, iar frecvența de excreție a micobacteriilor este cu 6-8% mai mare decât în ​​mediul Levenshteyn-Jensen.

Pentru a îmbunătăți eficiența diagnosticului bacteriologic al tuberculozei extrapulmonare, se recomandă includerea mediilor modificate Finn-II în complexul de medii nutritive. Pentru a accelera creșterea, se adaugă tioglicolat de sodiu (0,05%) în mediul nutritiv Finn-II, care reduce concentrația de oxigen. Pentru a proteja sistemele enzimatice micobacteriene de produsele peroxidante lipidice toxice, antioxidantul acetat de α-tocoferol este introdus în mediul nutritiv Finn-II la o concentrație de 0,001 μg / ml. Semănarea materialului de diagnosticare produs prin metoda standard.

În laboratoarele de tuberculoză din Rusia sunt utilizate alte modificări ale mediilor nutritive dense; propus de G.G. Mediul nutritiv mordovian "Nou", dezvoltat de V.A. Mediul nutritiv Anikin A-6 și A-9, etc.

Datorită faptului că, în timpul chimioterapiei, diferite sisteme metabolice ale celulei microbiene sunt deteriorate, o parte a populației micobacteriene își pierde capacitatea de a se dezvolta în mod normal pe medii nutritive obișnuite și necesită medii nutritive echilibrate osmotic (semi-lichide sau lichide).

Evaluarea și înregistrarea rezultatelor materialului de însămânțare

Unele tulpini și tipuri de micobacterii cresc lent, creșterea poate să apară chiar și în cea de-a 90-a zi. Numărul acestor culturi este mic, dar le face să reziste culturilor într-un termostat timp de 2,5-3 luni.

Culturile virulente de Mycobacterium tuberculosis cresc de obicei pe ouă densă sub formă de colonii în formă de R de diferite mărimi și tipuri. Coloniile sunt uscate, încrețite, fildeș, ușor pigmentate. În alte medii, coloniile de Mycobacterium tuberculosis pot fi mai umede. După un curs de chimioterapie sau în cursul tratamentului, pot fi eliberate colonii netede cu creștere umedă (forme S).

La izolarea culturilor se utilizează un complex de studii speciale care permit distingerea micobacteriei tuberculozei de micobacterii netuberculoase și saprofite rezistente la acid.

Un răspuns pozitiv este dat după o examinare microscopică obligatorie a unui frotiu colorat cu Zil-Nelsen din colonii crescute. În cazul creșterii micobacteriilor în frotiuri se găsesc tije roșii stralucitoare, situate singure sau în grupuri, formând grupuri sub formă de pâslă sau panglică. În culturile tinere, izolate în special de la pacienții tratați cu chimioterapie pentru o lungă perioadă de timp, micobacteriile se caracterizează printr-un polimorfism pronunțat, până la prezența unor variante scurte, aproape coccoide sau alungite, similare cu miceliul fungic, împreună cu formele în formă de tijă.

Rata de creștere a micobacteriilor este indicată prin următoarea schemă: (+) - 1-20 CFU într-un tub de testare (excreție bacteriană redusă); (++) - 20-100 CFU in vitro (excreție bacteriană moderată); (+++) -\u003e 100 CFU in vitro (excreție abundentă de bacterii). În diagnosticul de laborator al tuberculozei, nu este suficient să se dea un răspuns, dacă miocobacteria este sau nu detectată prin această metodă sau prin aceasta. au o înțelegere detaliată a volumului și naturii populației micobacteriene, a compoziției și a proprietăților acesteia. Aceste date fac posibilă interpretarea corectă a stării procesului, planificarea tacticii și corectarea promptă a tratamentului.

ultimii ani Pentru a accelera creșterea micobacteriilor s-au propus medii nutritive pe bază de agar cu diferite suplimente de creștere și utilizarea unui amestec special de gaze. Pentru a obține creșterea micobacteriilor în aceste medii în timpul cultivării, creați o atmosferă cu un conținut ridicat de dioxid de carbon (4-7%). În acest scop, se utilizează incubatoare speciale de CO2. Cu toate acestea, cele mai dezvoltate sisteme automate de cultivare a micobacteriilor: MGIT-BACTEC-960 și MB / Bact.

Unul dintre aceste sisteme este sistemul MGIT (tubul de indicare a creșterii micobacteriilor), care aparține dezvoltării tehnologiilor înalte și este conceput pentru a accelera diagnosticul bacteriologic al tuberculozei și a determina sensibilitatea micobacteriilor la medicamentele de primă linie și la unele medicamente de linia a doua. MGIT se concentrează pe utilizarea acestuia ca parte a dispozitivului VASTES-960. Microorganismele sunt cultivate în tuburi speciale de testare cu un mediu nutritiv lichid pe baza mediului modificat Middlebrook-7H9. Pentru stimularea creșterii micobacteriilor și inhibarea creșterii microflorei străine, se utilizează suplimente de creștere MGIT Growth Supplement și un amestec de medicamente antibacteriene PANTA.

Creșterea microbiană este înregistrată optic. Se bazează pe fluorescența care rezultă din consumul de oxigen prin micobacterii în procesul de creștere. Un colorant fluorocrom dependent de oxigen este conținut în partea de jos a tubului de testare special și este acoperit cu un strat de silicon. Înmulțirea micobacteriilor conduce la o scădere a cantității de oxigen din tub și la o scădere a concentrației acestuia, ceea ce determină o creștere a fluorescenței, care devine vizibilă atunci când tubul este iradiat cu lumină ultravioletă și detectat automat de senzorii foto încorporați în dispozitivul VASTES-960. Intensitatea strălucirii înregistrată în unități de creștere (unități de creștere GU). Datele de creștere sunt introduse într-un computer unde pot fi salvate automat. Analiza computerizată a curbelor de creștere poate furniza informații privind prezența diferitelor bazine micobacteriene, inclusiv a celor non-tuberculoase și, de asemenea, ajută la evaluarea proprietăților de creștere ale micobacteriilor.

Ca urmare a introducerii unor astfel de sisteme, timpul de apariție a creșterii micobacteriilor a fost semnificativ redus, în medie 11 zile pe VASTES-960 și 19 zile pe MB / Bact comparativ cu 33 de zile pe un mediu nutritiv standard dens. Trebuie remarcat faptul că aceste sisteme necesită personal de înaltă calificare. Materialul de însămânțare pe medii lichide trebuie să fie însoțit de însămânțarea pe mediul Levenshteyn-Jensen, care joacă rolul unui stand-in în cazurile în care tuberculoza nu dă naștere creșterii pe alte medii.

Determinarea sensibilității la medicament a micobacteriilor

Determinarea spectrului și a gradului de sensibilitate a micobacteriilor la medicamentele anti-tuberculoză are o importanță clinică importantă, precum și pentru evaluarea epidemiologică a răspândirii tuberculozei rezistente la medicamente. În plus, monitorizarea rezistenței la medicamente face posibilă evaluarea eficacității programului de tuberculoză în ansamblu, fiind un indicator integral al performanței tuturor componentelor măsurilor de tuberculoză.

Multiplicitatea și calendarul sensibilității la medicament:

• înainte de a începe tratamentul o dată pentru a determina strategia și tactica tratamentului:
• când se izolează culturile pacientului din diferite materiale (spută, BAL, urină, exudate, lichior etc.), toate tulpinile izolate sunt examinate:
• la sfârșitul fazei intense de tratament în absența dinamicii clinice și radiologice:
• dacă este necesar, modificați regimul de tratament în cazul:
  • lipsa negativității sputei;
  • re-cultura după negativitatea sputei;
  • o creștere accentuată a numărului de KUM din frotiu după scăderea inițială. Este bine cunoscut faptul că tulpinile de Mycobacterium tuberculosis care sunt eterogene în ceea ce privește sensibilitatea la medicament sunt izolate din materialul de la un pacient cu tuberculoză. Sensibilitatea tulpinilor la medicamentele anti-tuberculoză poate diferi în domeniul medicamentelor, gradul, frecvența și rata de rezistență.

Gradul de rezistență la medicament al Mycobacterium tuberculosis este determinat în conformitate cu criterii stabilite, care se concentrează asupra semnificației clinice a rezistenței și depind de activitatea anti-tuberculoasă a medicamentului, de farmacocinetica lui și de concentrația în leziune. doza terapeutică maximă și așa mai departe.

Determinarea sensibilității la medicament a micobacteriilor se realizează în prezent prin metode microbiologice:

• concentrații absolute (metoda de diluare pe medii nutritive solide sau lichide);
• proporții,
• coeficient de rezistență.

Rezistența se manifestă, de obicei, sub forma creșterii observate vizual a coloniilor de Mycobacterium tuberculosis, dar există tehnici care induc creșterea în stadiile incipiente ale diviziunii celulelor Mycobacterium sub formă de reacții de culoare. Aceste metode reduc timpul testului de la 3-4 la 2 săptămâni.

Metoda de concentrații absolute recomandată de Comitetul pentru Chimioterapie al OMS, care din punct de vedere metodologic este cea mai simplă, dar necesită o înaltă standardizare și acuratețe a procedurilor de laborator, a devenit răspândită în Rusia. Testul de susceptibilitate la medicament constă într-un set de tuburi cu un mediu nutritiv modificat cu medicamente anti-tuberculoză. Trusa este alcătuită din 2-3 tuburi cu concentrații diferite ale fiecăruia dintre medicamentele utilizate, un tub de control cu ​​mediu fără medicament și un tub conținând 1000 μg / ml salicilat de sodiu sau 500 μg / ml acid para-nitrobenzoic pentru a detecta creșterea micobacteriilor netuberculoase.

Pentru prepararea unui set de medii cu medicamente folosind un mediu modificat Lowenstein-Jensen (fără amidon), care este turnat în flacoane. În fiecare dintre baloane se adaugă o anumită cantitate din diluția corespunzătoare a medicamentului anti-TB. Conținutul baloanelor se amestecă bine, se toarnă în eprubete și se coagulează într-o poziție înclinată timp de 40 de minute la o temperatură de 85 ° C. Se recomandă coagularea mediului într-o șurubelniță electrică cu control automat al temperaturii. Mediu cu medicamente anti-tuberculoză

Primul rând poate fi păstrat la frigider la 2-4 ° C timp de o lună, cu medicamente de pe rândul 2 - nu mai mult de 2 săptămâni. Mediile de stocare cu medicamente la temperatura camerei sunt inacceptabile. Atunci când se prepară soluții de medicamente anti-tuberculoză, se ia în considerare activitatea lor, calculând concentrația, ajustată pentru greutatea moleculară a părții nespecifice a medicamentului, puritatea etc. Pentru a determina sensibilitatea medicamentului folosind numai substanțe chimic pure.

Principiul metodei constă în determinarea concentrației medicamentului anti-tuberculoză, care suprimă creșterea unei părți semnificative a populației micobacteriene. Când este făcut corect, această metodă are o precizie bună.

Înainte de testare, trebuie să vă asigurați că cultura selectată de Mycobacterium tuberculosis nu are microfloră străină. Dintr-o cultură de micobacterii în soluție de clorură de sodiu 0,9%, se prepară o suspensie omogenă conținând 500 milioane de celule microbiene în 1 ml (standard de turbiditate optică de 5 unități). Suspensia rezultată este diluată cu soluție de clorură de sodiu 0,9% (1:10) și 0,2 ml de suspensie este adăugată la fiecare tub dintr-un set de medii nutritive. Tuburile de sticlă sunt plasate într-un termostat la 37 ° C și ținute într-o poziție orizontală timp de 2-3 zile, astfel încât suprafața mărunțită a mediului nutritiv să fie inoculată uniform cu o suspensie de tuberculoză micobacteriană. Apoi tuburile sunt transferate în poziție verticală și incubate timp de 3-4 săptămâni. Măsurarea rezultatelor se efectuează în 3-4 săptămâni.

Întrucât momentul izolației agentului patogen din materialul clinic pe medii nutritive este de cel puțin 1-1,5 luni, rezultatele determinării sensibilității medicamentului prin această metodă pot fi obținute nu mai devreme de 2-2,5 luni după însămânțarea materialului. Acesta este unul dintre principalele dezavantaje ale metodei.

Interpretați rezultatele determinării sensibilității la micobacterii în funcție de anumite criterii. Pe medii dense, cultura este considerată a fi sensibilă la concentrația medicamentului care este conținută în mediu dacă numărul de colonii de micobacterii crescute pe acest tub cu medicamentul nu depășește 20 cu creștere abundentă pe tubul de control fără medicamente. Numai în prezența a mai mult de 20 de colonii, cultura este considerată ca fiind rezistentă la această concentrație. În practică, atunci când obțineți rezultate de creștere în tuburi de testare aproape de 20 CFU. este necesar să se notifice unității clinice că sensibilitatea sau stabilitatea în acest caz are un caracter limită, deoarece acest lucru poate uneori explica dinamica vagă a indicatorilor clinici.

Pentru diferite medicamente, se stabilește o anumită concentrare la care se observă multiplicarea populației critice de micobacterii. Aceste concentrații sunt numite "critice". Ca criteriu de stabilitate, se utilizează rata de creștere a populației micobacteriene pe mediul nutritiv cu medicamentul într-o concentrație critică.

În practica ftiziologică internă în determinarea rezistenței la medicament nu se limitează la determinarea numai a concentrațiilor critice. Acest lucru se datorează faptului. că determinarea extinsă a nivelului de rezistență la medicament a agentului patogen permite clinicianului să formeze mai corect tactici de chimioterapie utilizând cunoștințele despre efectul de potențare a combinațiilor de medicamente, să anticipeze rezistența încrucișată sau să aplice medicamente mai eficiente din grupul de medicamente anti-tuberculoză utilizate.

Metoda concentrațiilor absolute este însă cea mai simplă și cea mai sensibilă la erorile de punere în aplicare. Mai de încredere, mai ales când se determină sensibilitatea la medicamentele de a doua linie, iar metoda proporțiilor este comună în afara Rusiei. Ea ține cont de deficiențele metodei de concentrare absolută, cu toate acestea, este mai mult consumatoare de timp de efectuat.

Metoda este foarte asemănătoare cu metoda de concentrare absolută. Pregătirea eprubetelor cu medicamente   produce același lucru. ca și în cazul metodei de concentrare absolută. Cu toate acestea, doza de însămânțare a unei suspensii de Mycobacterium tuberculosis este redusă de 10 ori. care ajustează frecvența rezistenței spontane a unor tulpini de Mycobacterium tuberculosis la medicamente precum etambutolul, protionamida, capreomicina. Ca control, utilizați 2 sau 3 tuburi cu o doză de semințe egală cu eprubetele, diluate în serie 10 și 100 de ori. Criteriul de rezistență este proporția creșterii observate vizual a Mycobacterium tuberculosis. Pentru medicamentele din primul rând, criteriul durabilității este un exces de creștere de 1% din populația inițială, pentru medicamentele din al doilea rând - creștere de 1 sau mai mult de 10% din valoarea inițială, în funcție de concentrația critică selectată.

În 1997, grupul de lucru al OMS și al Uniunii Internaționale pentru Combaterea Tuberculozei pentru detectarea rezistenței la medicament împotriva tuberculozei a făcut ajustări acestor criterii, sugerând că micobacteriile care cresc pe mediul dens de ouă din Levenshteyn-Jensen sunt considerate stabile la următoarele concentrații:

• dihidrostreptomicină - 4 pg / ml;
• isoniazid - 0,2 μg / ml:
• rifampicină - 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

În 2001, s-au propus concentrații critice pentru următoarele medicamente de a doua linie (pentru o proporție critică de 1%):

• capreomicină - 40 μg / ml;
• protionamidă - 40 μg / ml;
• kanamicină - 30 pg / ml;
• viomicină - 30 pg / ml;
• cicloserină - 40 pg / ml;
• acid aminosalicilic - 0,5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Rezultatele de creștere sunt evaluate după 4 săptămâni ca preliminare și după 6 săptămâni de cultivare ca final.

Pentru a determina sensibilitatea la pirazinamidă, care este utilizat pe scară largă în chimioterapia modernă a tuberculozei, concentrația critică recomandată este de 200 μg / ml. Cu toate acestea, încă nu există o metodă general acceptată pentru determinarea rezistenței medicamentului la acest medicament pe medii nutritive solide, deoarece activitatea sa antibacteriană se manifestă numai într-un mediu acid (pH

Pentru a evalua calitatea rezultatelor determinării sensibilității la micobacterii a medicamentului, se recomandă ca fiecare lot nou de mediu Levenshteyn-Jensen să fie monitorizat printr-o determinare paralelă a sensibilității tulpinii muzeografice standard H37Rv. În plus, există anumite criterii microbiologice care trebuie îndeplinite pentru ca metodologiile să producă un rezultat bine reproductibil și corect interpretabil. Acestea includ viabilitatea culturii de Mycobacterium tuberculosis, regulile pentru obținerea unei suspensii și suspensii omogene, regulile pentru selectarea culturilor de Mycobacterium tuberculosis, reprezentativitatea masei bacteriene selectate. Fiabilitatea determinării rezistenței la medicament scade cu excreția extrem de slabă a bacteriilor.

Recent, o metodă promițătoare recunoscută pentru determinarea sensibilității medicamentului utilizând sisteme automate. Cele mai avansate în acest domeniu sunt evoluțiile bazate pe DEȘEURI MGIT-960. În acest caz, sensibilitatea la medicament a mycobacterium tuberculosis se determină pe baza unei metode modificate de proporții. În procesul de determinare, rata de creștere a tuberculozei mycobacterium este comparată în tubul de control și în tuburile de testare cu medicamente. Îmbogățirea suplimentelor și antibioticelor incluse în kitul SIRE sunt utilizate pentru a determina sensibilitatea la streptomicină, izoniazid, reef-picin și etambutol. Pentru a determina sensibilitatea la pirazinamidă, utilizați kitul PZA. În timpul testului, suspensia de tuberculoză mycobacterium este inoculată cu tuburi de testare cu medicamente, precum și tuburi de control cu ​​diluție de suspensie de 100 de ori pentru toate preparatele, cu excepția pirazinamidei, în cazul în care diluția suspensiei este de 10 ori. Criteriul de durabilitate este indicatorul creșterii micobacteriilor de 100 GU când se atinge creșterea tubului de control de 400 GU (vezi "Metode culturale pentru izolarea micobacteriilor"). Contabilitatea și interpretarea rezultatelor sunt efectuate automat și sunt stabilite de programul care este introdus sau selectat.

Concentrațiile finale din tubul de testare cu un mediu nutritiv lichid sunt utilizate ca concentrații critice. În prezent, au fost dezvoltate concentrații critice atât pentru medicamentele de primă linie, cât și pentru medicamentele de linia a doua. Trebuie menționat faptul că determinarea sensibilității Mycobacterium tuberculosis la cicloserină și acidul aminosalicilic se efectuează numai pe mediile nutritive din ouă.

Protocolul de lucru detaliat pentru sistemul descris permite studiul sensibilității medicamentului atât pe cultura izolată (cu un mediu nutritiv dens), cât și pe utilizarea primară a micobacteriului într-un tub MGIT. Această din urmă opțiune reduce în mod semnificativ timpul studiilor culturale, permițându-vă să obțineți rezultate complete asupra culturii de Mycobacterium tuberculosis (inclusiv informații despre sensibilitatea la medicament) după 3 săptămâni de la data colectării materialului, în timp ce metoda tradițională poate fi obținută abia în a treia lună. Timpul obținut, atunci când pacientul se află în faza intensivă de tratament, poate compensa costul relativ ridicat al cercetării.

Diferențierea micobacteriilor

Ținând cont de faptul că mediile de nutrienți utilizate nu sunt strict selective. diferențierea ulterioară a micobacteriilor izolate este recunoscută ca fiind obligatorie. Nevoia de diferențiere a micobacteriilor se datorează mai multor trăsături ale proceselor patologice cauzate de reprezentanții genului: evoluția și evoluția diferită a tuberculozei și micobacteriei, prezența rezistenței la medicamente naturale la unele medicamente anti-tuberculoză.

Este recunoscut faptul că identificarea primară a micobacteriilor complexului M. tuberculosis din micobacterii netuberculoase se realizează conform următoarelor caracteristici: viteza de creștere pe suporturi nutritive dense, formarea pigmentului, morfologia coloniei, prezența rezistenței la acid și optimul temperaturii de creștere.

Din păcate, nu există o metodă de laborator care să distingă în mod fiabil micobacteriile complexului M. tuberculosis de alte micobacterii rezistente la acid, cu toate acestea, combinarea semnelor de mai sus cu rezultatele mai multor teste biochimice date mai jos ne permite să identificăm micobacteriile complexului M. tuberculosis cu probabilitate 95%.

Pentru a diferenția micobacteriile complexului M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii și alții) din micobacterii non-tuberculoase în creștere lentă, teste biochimice de bază sunt utilizate pentru a detecta prezența următoarelor semne:

• capacitatea de a produce acid nicotinic (test de niacin):
• activitatea de reductază a nitratului;
• catalază termostabilă;
• creșterea pe mediu cu salicilat de sodiu (1 mg / ml).

Ca supliment, puteți utiliza, de asemenea, teste de creștere pe un mediu care conține 500 μg / ml acid para-nitrobenzoic sau 5% clorură de sodiu.

Multe laboratoare bacteriologice identifică aceste microorganisme numai la nivelul complexului, datorită capacităților limitate ale laboratoarelor și capacităților metodologice ale specialiștilor.

În majoritatea cazurilor, în practică pentru diferențierea M. tuberculosis și M. bovis, următoarele teste sunt suficiente: niacin, pentru prezența nitrat reductazei, pentru prezența pirazinamidazei și înregistrarea creșterii pe un mediu conținând 2 pg / ml de hidrazid de acid tiofen-2-carboxilic. În același timp, se ia în considerare faptul că micobacteriile complexului M. tuberculosis sunt caracterizate prin următoarele caracteristici:

• creștere lentă (mai mult de 3 săptămâni);
• temperatură de creștere în intervalul 35-37 o C;
• lipsa formării pigmentului (culoarea fildeșului);
• o culoare pronunțată împotriva acidului;
• aluat niacin pozitiv;
• testul pozitiv al reductazei nitraților;
• absența catalazei termostabile (68 o C).
• lipsa de creștere a mediului înconjurător Lowenstein-Jensen, care conține:
  • 1000 pg / ml salicilat de sodiu,
  • 500 pg / ml acid paranitrobenzoic,
  • 5% clorură de sodiu:
• creștere în prezența a 1-5 pg / ml acid tiofen-2-carboxilic.

Relevanța diferențierii micobacteriilor izolate va crește considerabil odată cu creșterea frecvenței înregistrării cazurilor de HIV / SIDA asociate cu tuberculoza sau micobacterioza. În prezent, nu există nicio certitudine absolută că laboratoarele regionale practice sunt pregătite să efectueze corect această operă.

Diagnosticul imunologic al tuberculozei

Există o serie de fenomene universale, medicamente și teste imunologice care au fost descoperite inițial în timpul tuberculozei sau pe modelul răspunsului imun la micobacterii. Acestea includ BCG și tuberculina, un fenomen precum HRT cutanat (teste de tuberculină - reacțiile Pirke și Mantoux), o reacție la administrarea subcutanată a tuberculinei la animalele sensibilizate (fenomenul Koch). Unii dintre primii anticorpi într-o boală infecțioasă au fost, de asemenea, găsiți în tuberculoză. Desigur, cu cât înțelegerea mecanismelor de imunitate anti-tuberculoză și controlul lor genetic este mai profundă, cu atât mai largă ar putea fi utilizarea metodelor imunologice și a medicamentelor care afectează sistemul imunitar pentru a rezolva problemele practice ale ftiziologiei.

Cea mai importantă și dificilă problemă practică este considerată în prezent detectarea tuberculozei în procesul de screening în masă a populației. Totuși, în ciuda numeroaselor rapoarte despre "succese" (pe materiale limitate), nu există o metodă imunologică adecvată (reprodusă în "orice mâini") și un preparat în acest scop.

Metodele imunologice, în special studiile serologice (definiția antigenei, anticorpii) și testele de provocare a tuberculinei, sunt utilizate pe scară largă în practica clinică.

În primul rând, printre studiile imunologice utilizate în diagnosticul diferențial, sunt metode serologice - definirea antigenilor și a anticorpilor în diferite medii ale corpului.

Specificitatea determinării anticorpilor față de tuberculoza mycobacterium depinde de antigenele utilizate în analiza imunității. A fost propusă o cantitate semnificativă de antigeni, dintre care prima este tuberculina PPD:

• PPD și alte preparate complexe din lichidul de cultură;
• cu dezintegrare ultrasonică;
• extract de triton și alte preparate complexe ale pereților celulari;
• 5 antigen (Daniel);
• 60 antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• factor de cord (trehaloză-6,6-dicicolat);
• fenolice și alte glicolipide;
• lipopolizaharidă;
• fibronectină;
• proteine ​​(cel mai adesea recombinant); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA și altele.

Ca rezultat al cercetărilor efectuate de cercetători ruși și străini de mai mulți ani, principalele tipare ale producției de anticorpi și eficacitatea diagnosticului serologic de tuberculoză au fost dezvăluite: cu cât antigenul este mai complex, cu atât este mai mare sensibilitatea și mai puțin specificitatea testelor. Specificitatea în diferite țări   diferă în funcție de infecția populației de M. tuberculosis și micobacterii netuberculoase, de vaccinarea BCG etc. La copii, informativitatea serodiagnozei este mai mică decât la adulți. În tuberculoza primară (adesea copii), definiția IgM este mai informativă. cu IgG secundar. În cazul informațiilor serodiagnotice infectate cu HIV, determinarea anticorpilor scade. Eficacitatea determinării anticorpilor depinde de un număr de "momente clinice": activitatea procesului (prezența sau absența "izolației" micobacteriilor, prezența cavităților de dezintegrare, gradul de infiltrare), amploarea procesului, durata cursului său.

Sensibilitatea metodei de imunotestare enzimatică (ELISA) este de aproximativ 70%. Lipsa eficacității studiului se datorează specificității sale scăzute. Anterior, a fost luată în considerare posibilitatea utilizării screeningului serologic la grupuri cu risc sporit, în special în rândul persoanelor cu modificări post-tuberculoză din plămâni.

Pentru a crește specificitatea testului ELISA, se continuă căutarea unor antigene mai specifice, inclusiv cele obținute prin ingineria genetică: ESAT-6 și altele (vezi mai sus). Utilizarea unor antigeni strict specifici (38 kDa, ESAT) mărește specificitatea. dar reduce semnificativ sensibilitatea analizei. Împreună cu ELISA (sisteme de testare experimentală de laborator, de exemplu, kitul ELISA Pathozyme), sunt oferite și kituri imunochromatografice cu filtrare laterală (Mycodot), precum și alte teste similare (punct-analiză pe membrană) cu evaluarea vizuală a rezultatului testului. La efectuarea acestor teste, analiza are loc în 10-30 de minute; ele nu necesită echipament special, necesită o evaluare vizuală a rezultatelor, care este asociată cu o subiectivitate cunoscută. Aceste metode au aproximativ aceleași caracteristici de sensibilitate și specificitate (70% și respectiv 90-93%) ca ELISA tradițional.

Utilizarea metodelor de analiză a imunității are o anumită valoare ca una suplimentară, luată în considerare în complexul metodelor utilizate, în diagnosticul diferențial al tuberculozei, în special în diagnosticarea formelor sale extrapulmonare. ELISA este cel mai eficient în diagnosticarea meningitei tuberculoase în studiul lichidului cefalorahidian. În acest caz, sensibilitatea analizei este de 80-85%, iar specificitatea este de 97-98%. Există dovezi ale eficacității determinării anticorpilor la miocobacterium tuberculosis în lichidul lacrimal în diagnosticul uveitei de tuberculoză.

Inducerea sintezei interferonului gama in vitro

Gamma-interferonul (IFN-γ) este un factor de apărare imună specifică care se realizează prin activarea sistemelor de enzime macrofage. Inducerea sintezei IFN-y de către limfocitele T sensibilizate cauzează interacțiunea lor cu antigeni micobacterieni.

Ca antigeni utilizați ca tuberculină PPD. și antigeni specifici obținuți prin ingineria genetică, în special antigeni ESAT-6 (antigen secretat timpuriu cu o masă moleculară de 6 kDa) și CFP-10 (filtrat de cultura de proteine, 10 kDa). Ingineria genetică sau antigenele recombinante sunt absente în celulele vaccinului BCG și al altor micobacterii. Atunci când se utilizează tuberculină, rezultatele testului de inducție IFN-γ sunt comparabile cu rezultatele testului cutanat tuberculină (corelație directă). Când se utilizează antigeni modificați genetic, rezultatele testelor sunt mai specifice și nu depind de vaccinarea BCG anterioară. La examinarea persoanelor vaccinate care nu au avut contact cu o infecție cu tuberculoză, specificitatea testului este de 99%. Sensibilitatea testului la pacienții cu tuberculoză variază de la 81 la 89%.

Teste și instrumente de diagnosticare au fost dezvoltate pe baza cultivării pe termen scurt a celulelor sau a celulelor mononucleare de sânge integral izolate din sânge cu antigene de Mycobacterium tuberculosis in vitro cu determinarea ulterioară a concentrației de IFN-γ sau prin numărarea numărului de limfocite T care sintetizează IFN-γ. Concentrația de interferon sintetizată in vitro, determinată prin ELISA utilizând anticorpi monoclonali care leagă IFN-y. Apoi, utilizând standardul de calibrare IFN-γ, se determină concentrația acestuia în eprubeta sau godeurile tabletei.

La efectuarea testului Elispot, numărul de limfocite T care sintetizează IFN-γ. numărate pe suprafața paharului, acoperite cu anticorpi la IFN-y.

dezvoltatorii de diagnostic pe baza inducției IFN-γ in vitro, care a fost aprobat de către Agenția Statelor Unite pentru Droguri și Produse, susțin că, cu ajutorul testului, este imposibilă diferențierea infecției la tuberculoza latentă de la tuberculoza activa. Prin urmare, în regiunile cu un nivel ridicat de infecție, testul nu are o valoare directă de diagnosticare. Cu toate acestea, în țara noastră, aceasta poate fi utilizată pentru a diferenția infecțiile tuberculozei la copii de la alergii post-vaccinare, precum și pentru a evalua nivelul imunității specifice în procesul de tratament.

În prezent, este studiat sistemul de testare internă pentru determinarea inducției sintezei de IFN-y prin antigeni specifici de tuberculoză in vitro.

Starea imunitară și evoluția tuberculozei, imunocorrecția

În procesul de tratare a tuberculozei la om, există schimbări în antigenemie și starea sistemului imunitar.

Datele privind modificările exsudatelor și țesuturilor sunt în mare parte contradictorii. Singurul lucru care poate fi remarcat pe bună dreptate este faptul că un număr semnificativ de limfocite T activate sunt de obicei găsite în granuloamele tuberculoase.

Este logic să ne ocupăm de alte două puncte care sunt necesare pentru a înțelege rolul mecanismelor imunologice în tratamentul tuberculozei la om:

• pacienții cu SIDA au o incidență deosebit de ridicată a rezistenței multidrugătoare;
• în cazul rezistenței multidrugătoare (și în absența infecției cu HIV), tulburările de imunitate (în primul rând, componenta celulară T) sunt deosebit de semnificative.

Când tuberculoza aplică pe larg diferite metode de imunomodulare: este în primul rând medicamente care acționează în principal asupra imunității celulelor T și un sistem de fagocitele mononucleare (hormonii timusului, izoforona, likopid, polioksidony et al.). precum și micobacteriile integrale (atenuate) și componentele acestora.

Diagnosticul biologic molecular al tuberculozei

Pentru metode de biologie moleculara in diagnosticul bolilor infecțioase includ, în principal, metode bazate pe manipularea cu materialul genomic al bacteriilor patogene și virale pentru a identifica materialul genetic specific - segmente de ADN având o secvență de nucleotide specifică pentru un anumit tulpini de tip sau patogene pentru a analiza specific Secvențe ADN în gene care determină sensibilitatea agentului patogen la anumite substanțe medicamentoase, precum și analiza funcției in inactivitatea anumitor gene ale agentului patogen. Metodele biologice biologice sunt utilizate pe scară largă în cercetarea științifică și în aplicații practice în diagnosticul și controlul diferitelor infecții bacteriene și virale după descoperirea în 1985 a lui Kerry Mulllis (câștigătorul Premiului Nobel 1989) al reacției în lanț a polimerazei.

Principii și posibilități ale metodei de reacție în lanț a polimerazei

PCR vă permite să amplificați (multiplicați) in vitro secvența de nucleotide (fragmentul de ADN patogen) pentru câteva ore de milioane de ori. Realizarea reacției în prezența lanțurilor unice de ADN determină sensibilitatea extrem de ridicată a analizei.

Secvența nucleotidică a anumitor secțiuni din lanțul ADN determină identitatea genetică a microorganismului, ceea ce explică specificitatea înaltă a PCR.

Valoarea acestei tehnici pentru detectarea și investigarea caracteristicilor determinate de caracteristicile biologice Mycobacterium tuberculosis ale unui microorganism având o creștere foarte lentă: timp de ADN Mycobacterium tuberculosis dublare când este cultivarea 12-24 ore.

Principiul metodei PCR este amplificarea - multiplă, de milioane de ori. multiplicarea secțiunilor dintr-o secvență ADN specifică într-un microvolum cu eprubete cu repetarea ciclică a următoarelor trei etape ale reacției, fiecare dintre acestea având loc într-un regim de temperatură diferit:

• Etapa I - denaturarea ADN-ului dublu catenar când este încălzită cu divergența lanțurilor sale;
• Etapa II - legarea complementară (hibridizarea) primerelor (oligonucleotide de primer) la secțiunile finale ale lanțurilor strict specifice alese pentru înmulțirea fragmentului ADN;
• Etapa III - finalizarea lanțului fragmentului ADN utilizând o ADN polimerază termostabilă.

Pentru amplificarea in vitro, trebuie să existe molecule ADN șablon. patru tipuri de trifosfați de deoxinucleozidă (nucleotide) care conțin bazele azotate corespunzătoare: adenina (A), timina (T), guanina (D), citozina (C); semințele oligonucleotidice de semințe sintetizate artificial (primeri) constând din perechi de 18-20 de baze; termostabilă ADN polimerază, având un optim de temperatură de 68-72 o C și ioni de magneziu.

Specificitatea PCR depinde de alegerea fragmentului ADN. În concordanță cu aceasta, se sintetizează oligonucleotidele din sămânța flancului. Specificitatea hibridării și completarea lanțului ADN este determinată de principiul complementarității următoarelor perechi de baze azotate: adenină-timină, guanină-citozină.

Pentru a determina genomul complexului de mycobacterium tuberculosis, cea mai eficientă țintă de amplificare în majoritatea sistemelor de testare a fost fragmentul ADN IS6110, care la majoritatea tulpinilor de tuberculoză mycobacterium are un număr semnificativ (10-20) de repetări în genom, care oferă, împreună cu specificitatea, o sensibilitate ridicată a analizei. În același timp, au fost descrise tulpini de Mycobacterium tuberculosis cu un număr mic de repetări sau lipsa unui fragment IS6110.

Izolarea moleculelor ADN dintr-o probă biologică

pentru efectuarea PCR   Moleculele ADN ale agentului cauzal trebuie să fie izolate din material biologic într-un volum minim, cu o cantitate minimă de ADN ne-insipid și inhibitori diferiți ai enzimei - ADN polimeraza.

Pregătirea probelor trebuie efectuată în condiții care împiedică contaminarea încrucișată a probelor supuse studiului de către moleculele de ADN secretate. Acest lucru necesită o tratare prealabilă a camerei cu lumină ultravioletă, podele și suprafețe de lucru ale meselor și aparatelor - soluții care conțin clor. De asemenea, este necesar să folosiți mănuși curate, tuburi de unică folosință și vârfuri pentru pipetele automate.

Pentru a izola ADN-ul Mycobacterium tuberculosis din probele clinice (lichidul cefalorahidian, lavajul bronșic) care nu conțin un număr mare de leucocite, resturi celulare sau săruri, este suficient să centrifugați proba la 3-4 mii de rotații pe minut, să adăugați 20-30 μl soluție 2% Triton X-100 și se încălzește la 90 ° C timp de 30 de minute.

Prepararea probelor de spută necesită o diluție eficientă, pentru care de obicei se utilizează soluție de hidroxid de sodiu 4% și N-acetil-L-cisteină (NALC) în cantitate de 50-80 mg pe probă, în funcție de vâscozitatea probei. Soluția NALC trebuie să fie preparată ex tempore sau pulberea de NALC poate fi adăugată în stare uscată direct în eșantion. După diluare, eșantioanele trebuie centrifugate timp de 15 minute la o temperatură de 3,5 - 4 mii rotații pe minut (3000 g) în tuburi de 50 ml cu capace cu șurub, adică în aceleași condiții care sunt recomandate pentru pregătirea înainte de însămânțare a sputei.

Pentru extragerea ADN-ului din metoda de peleți este utilizată cel mai adesea bazate pe utilizarea unei soluții de 5-6 molar de reactiv de lizare izotiocianat de guanidină ca și particulele microporoase și oxidul de siliciu ( „pământ de diatomee“) sorbent molecula de ADN. Substanțele nespecifice, inclusiv inhibitorii posibili, sunt apoi spălați într-o soluție 2,5 molar de izotiocianat de guanidină și o soluție de etanol, după care moleculele ADN sunt desorbite în apă și aceste probe sunt utilizate pentru PCR. Pentru a simplifica tehnologia de extracție a ADN-ului, "pământul de diatomee" este adesea înlocuit cu microparticule magnetice acoperite cu oxid de siliciu. În același timp, în loc de centrifugare, se utilizează un tub magnetic special pentru tuburi microtest pentru precipitarea particulelor.

În Rusia a fost elaborată o metodă originală de separare imunomagnetică a micobacteriilor, urmată de extracția ADN-ului patogen. Pentru separarea imunomagnetică a tuberculozei mycobacterium se utilizează ferroparticule de dimensiune de 3-5 μm acoperite cu oxid de siliciu, la care sunt atașați anticorpi policlonali (iepuri) la micobacterii tuberculozei prin legare chimică. După liza alcalină, probele de spută sunt neutralizate cu o soluție acidă de Tris-HCI și incubate cu un sorbent imunomagnetic. Apoi, particulele imunopotice sunt colectate folosind un baston magnetic cu vârful înlocuibil, transferat într-un microvial, precipitat. Se aplică 20-30 pl dintr-o soluție 2% Triton X-100 și se încălzesc timp de 30 de minute la 90 ° C. Supernatantul este utilizat ca șablon ADN pentru analiza PCR.

O problemă dificilă este izolarea ADN-ului Mycobacterium tuberculosis din probele de biopsie. Pentru liza biopsiei se folosește enzima - proteinază K la o concentrație finală de 200-500 mg / l la o temperatură de 56 ° C cu noaptea. Apoi, alocați una dintre metodele cunoscute. ADN-ul nespecific excesiv în analiza PCR a probelor de biopsie servește adesea ca motiv pentru inhibarea reacției, ceea ce necesită extracția repetată a ADN-ului.

Metode de detectare a rezultatelor

După terminarea reacției, fragmentele ADN amplificate ale agentului patogen sunt identificate utilizând diferite metode.

O metodă bine cunoscută de electroforeză în gel. În același timp, fragmentul ADN obținut este identificat printr-un control pozitiv, conținând fragmentul ADN specific dorit sau printr-o dimensiune cunoscută anterior (numărul de perechi de nucleotide) a fragmentului, care este determinată utilizând un marker molecular standard.

În prezența unui colorant specific, bromura de etidiu, încorporată în ADN dublu catenar. Fragmentul de ADN sintetizat este detectat ca o bandă strălucitoare sub acțiunea radiației ultraviolete.

Mărimea fragmentului ADN, determinată prin electroforeză la distanța de la început, trebuie să corespundă unui marker de greutate moleculară cunoscută sau unui control pozitiv.

Alte metode de determinare a rezultatelor PCR bazate pe hibridizarea unui singur lant de produse PCR cu oligonucleotide complementare la aceasta - probă de ADN marcat cu biotină, urmată de detecție prin reacții enzimatice, de exemplu prin legarea la fosfatază alcalină streptavidină biotina.

Pe baza acestui tip de detectare, s-au creat analizoare PCR, în care detectarea rezultatelor PCR se efectuează automat ca urmare a citirii densității optice în probele după ce a avut loc o reacție enzimatică.

Dezavantajele acestor metode constau în posibilitățile de contaminare intralaboratorie cu fragmente destul de scurte de molecule de ADN. Aceste molecule, atunci când sunt eliberate în probele nou investigate, devin matricea PCR și conduc la rezultate fals pozitive.

În acest sens, pentru a preveni rezultatele fals pozitive, sunt introduse reguli stricte pentru separarea și izolarea incintelor: pentru izolarea ADN-ului din probe biologice; premisele pentru detectarea rezultatelor (electroforeza) din zona curată. Aceste încăperi reprezintă o zonă potențială de contaminare. O altă zonă izolată este o încăpere curată pentru introducerea probelor de test de ADN în eprubete cu amestecul de reacție pentru PCR. Și în final, se presupune că dispozitivul principal - amplificatorul ADN - ar trebui mutat într-o cameră separată, eventual de birou.

Pentru a preveni contaminarea cu produsele din reacțiile anterioare - cu amperi, unele sisteme de testare PCR în loc de deoxynucleozid timidină conțin deoxinucleoziduridă, care este sintetizată in vitro în loc de aceasta în poziția corespunzătoare, adică baza de azot a timinei, care este prezentă în ADN-ul nativ, este înlocuită cu uracil. Glicozilaza uracil-ADN, adăugată la amestecul de reacție la materialul de analizat, distruge numai fragmentele contaminante cu deoxiuridină, dar nu și ADN-ul nativ analizat. conținând deoxitimidină. Încălzirea ulterioară la 94 ° C inactivează această enzimă și nu interferează cu amplificarea prin PCR.

Există un sistem de testare bazat pe amplificarea izotermică a ARNm, pentru care se efectuează mai întâi transcrierea și sinteza inversă a moleculelor de ADN. care, la rândul său, este un model pentru sinteza ulterioară a moleculelor de ARN. Ampliconii de ARN sunt detectați utilizând o sondă de ADN colorată cu acridină când este hibridizată în soluția tubului de reacție. Această metodă, pe lângă sensibilitatea ridicată, are avantajul de a efectua analiza într-un singur eprubetă, care împiedică contaminarea. Potrivit autorilor, sensibilitatea acestei metode în probele respiratorii atinge 90% cu o specificitate de 99-100%.

Noi metode de detectare sunt implementate în PCR în timp real. Aceste metode se disting în primul rând prin faptul că PCR și detectarea rezultatelor sale sunt efectuate simultan într-un tub închis. Acest lucru nu doar simplifică tehnologic metoda de analiză, ci previne, de asemenea, contaminarea camerelor de laborator și a probelor de testare cu produse care preced PCR.

În timpul PCR în timp real, detectarea rezultatelor apare datorită fluorescenței care rezultă din hibridizarea unei probe de ADN fluorogenic cu un fragment ADN specific amplificat în timpul PCR. Structura probelor de ADN fluorogenice este construită astfel încât markerul fluorescent să fie eliberat ca urmare a reacției enzimatice sau să se distanțeze de molecula de stingere a fluorescenței numai în timpul hibridării specifice cu molecula ADN dorită amplificată în timpul PCR. Cu o creștere a numărului de molecule hibridizate cu o probă, o creștere a fluorescenței până la un nivel detectabil este proporțională cu numărul de molecule ale produsului amplificat. Deoarece numărul de molecule de fragment de ADN este dublat în timpul fiecărui ciclu de PCR, numărul ciclului din care este determinată și crescută fluorescența este invers proporțional cu numărul moleculelor de ADN din proba inițială. Dacă mai multe concentrații cunoscute de molecule ale fragmentului ADN corespunzător al Mycobacterium tuberculosis sunt introduse în reacție ca calibrator, atunci numărul genomilor ADN din materialul studiat poate fi calculat folosind un program de calculator.

Fiecare eșantion standard este duplicat. Un criteriu cantitativ este numărul minim de cicluri PCR necesare pentru debutul și creșterea fluorescenței detectate. Abcesul este numărul de cicluri; axa ordonată este valoarea fluorescenței. Concentrația ADN-ului este invers proporțională cu numărul de cicluri necesare pentru apariția fluorescenței. În ferestrele din coloana din dreapta (21-32) numerele de cicluri sunt marcate pentru respectivele concentrații. Diferențe între concentrațiile de 10 ori ale fragmentelor ADN 10 2-10 6 ml - 3,2-3,4 cicluri. Pentru doi pacienți, concentrația de fragmente IS6110 a fost de aproximativ 10 3 / ml și 10 4 / ml. Având în vedere numărul de repetiții (6-20) din fragmentele analizate din genomul Mycobacterium tuberculosis, numărul de micobacterii din probele clinice este de aproximativ 100 și, respectiv, 1000 de celule.

Utilizarea PCR în diagnosticul tuberculozei

Metoda PCR este cea mai utilizată pentru diagnosticul accelerat de tuberculoză - detectarea tuberculozei mycobacterium în probele clinice: sputa. bronhiile, exsudatul pleural, urina, lichidul cefalorahidian, osteoliza punctate, aspirațiile pentru tractul genital feminin și diverse specimene de biopsie. Într-un studiu efectuat în Olanda cu privire la 500 de specimene de spută și tampoane bronșice de la 340 de pacienți cu diagnostic confirmat de tuberculoză pulmonară, a fost studiată sensibilitatea comparativă a PCR, a culturii și a microscopiei de smear. Sensibilitatea analizei a fost de 92,6,88,9, respectiv de 52,4%. În acest caz, specificitatea tuturor metodelor a fost de aproximativ 99%.

A fost făcută o comparație a eficienței de detectare a microbacteriei tuberculozei prin metode de microscopie de smear, însămânțare pe mediu Lowenstein-Jensen, sistem de testare a deșeurilor și analiză PCR. PCR a arătat o sensibilitate de 74,4%, microscopie - 33,8%, însămânțare pe un mediu dens - 48,9% și DEȘEURI - 55,8%. Timpul mediu de detectare pentru însămânțare pe mediu Levenshtein-Jensen este de 24 de zile. DEȘEURI - 13 zile, PCR - 1 zi.

oportunități aplicații PCR   ca fiind sensibil și rapidă   Controlul eficacității tratamentului tuberculozei este, de asemenea, discutat.

Detectarea ADN a tuberculozei Mycobacterium metoda PCR   cu chimioterapie eficientă, se determină pe o perioadă mai lungă de timp - o medie de 1,7 luni comparativ cu excreția bacteriană determinată prin microscopie fluorescentă și 2,5 luni comparativ cu examinarea bacteriologică.

Diagnosticul tuberculozei extrapulmonare

Valoarea PCR ca metodă sensibilă este deosebit de importantă pentru formele extrapulmonare, deoarece în aceste forme metodele clinice cu raze X și metodele bacteriologice tradiționale pentru determinarea tuberculozei mycobacterium în materialele de diagnosticare sunt ineficiente.

În studiul probelor de urină, rezultatele analizei PCR au fost pozitive la 16 din 17 pacienți cu tuberculoză activă a sistemului urinar și negativi la 4 pacienți cu tuberculoză inactivă a rinichilor și 39 pacienți cu boli non-tuberculoase ale sistemului urinar.

Eficacitatea analizei PCR a fost demonstrată în studiul aspirațiilor măduvei osoase la pacienții cu febră genetică neclare în suspiciunea naturii tuberculoase a bolii. Pentru diagnosticul de limfadenită tuberculoasă la copii, au fost studiate 102 probe de aspirație punctiformă și biopsie, din 67 de copii cu limfadenită tuberculoasă suspectată. Rezultatele pozitive au fost obținute: prin PCR în timp real - 71,6%. fluorescentă microscopie - 46,3%. studii culturale - 41,8%. Într-un studiu efectuat la 50 de biopsii ale ganglionilor limfatici la pacienții cu boală de zgârieturi la pisică, toate rezultatele au fost negative. Astfel, a fost demonstrată specificitatea 100% a analizei PCR. În aceeași lucrare, cu biopsia punctiformă a ganglionilor limfatici, sa arătat posibilitatea de a detecta M. avium.

Diagnosticul tuberculozei genitale feminine cu infertilitate este cunoscut ca fiind una dintre cele mai dificile probleme de diagnostic. În studiul folosind biopsii endometriale, aspirate endometriale și probe de lichid din spațiul Douglas, 14 (56%) din 25 de pacienți examinați laparoscopic cu tuberculoză suspectată au prezentat rezultate pozitive. Folosind microscopia de smear și studiile de cultură, 1 și 2 au fost obținute, respectiv, rezultate pozitive. Aceste cazuri au fost de asemenea PCR pozitive. Majoritatea rezultatelor PCR pozitive legate de cazurile cu semne caracteristice ale tuberculozei în funcție de examinarea histologică; un număr mai mic - cu tuberculoză suspectată în funcție de laparoscopie. Numai o analiză PCR pozitivă a fost obținută în absența datelor laparoscopice pentru tuberculoză.

La diagnosticarea formelor extrapulmonare de tuberculoză, clinicienii au adesea o întrebare despre posibilitatea de a detecta agentul patogen în studiul PCR al probelor de sânge. Datele din literatură indică faptul că detecția ADN a Mycobacterium tuberculosis din probele de sânge este posibilă cu forme avansate de infecție cu HIV. Mycobacterium tuberculosis ADN a fost detectat numai în cazul tuberculozei generalizate a diferitelor organe la pacienții cu rinichi transplantat și imunodepresie.

Identificarea speciilor de micobacterii

Metoda PCR poate fi destul de eficientă pentru identificarea rapidă a complexului mycobacterium tuberculosis și a unor tipuri de micobacterii netuberculoase după creșterea lor inițială. În acest caz, utilizarea PCR poate economisi 7-10 zile pentru identificarea culturală ulterioară a unui rezultat pozitiv. Cercetarea prin PCR este foarte simplă din punct de vedere tehnic, deoarece nu necesită prepararea complexă a probelor de material clinic pentru a atinge o sensibilitate ridicată. În studiul a 80 de culturi pozitive într-un astfel de sistem de testare (MB VasT, de la compania Organon), toate rezultatele pozitive ale analizei PCR au fost strict specifice și au fost efectuate timp de 1 zi. Pentru a identifica alte specii de micobacterii în prepararea ADN-ului culturii patogen hibridizate cu sonde ADN specifice marcate cu acridină și tulpinile detectate prin apariția chemoluminescente prin fâșii chemiluminometru sau nitroceluloză cu o evaluare vizuală după hibridizare. Cu acest kit, se identifică un număr limitat de specii: complexul Mycobacterium tuberculosis. M. avium, complexul M. avium, M. kansasii și M. gordonae.

A.Telenti și colab. Ei au dezvoltat, de asemenea, o metodă relativ simplă și ieftină de identificare a speciilor de micobacterii clinic importante bazate pe PCR și prelucrarea ulterioară cu două enzime de restricție (enzime care au proprietățile de a taia molecula ADN la anumite puncte). Atunci când acest lucru este amplificat, fragmentul ADN. care codifică proteina de șoc termic (65 kDa), după care fragmentul ADN al perechilor de 439 nucleotide obținute prin PCR este procesat separat de două enzime - Bste II și Hae III. Apoi, folosind electroforeza pe gel de agaroză, se analizează cele două produse obținute, determinându-se mărimea acestora (numărul de perechi de nucleotide) utilizând un set de fragmente ADN standard (markeri ADN moleculari) cu o lungime cuprinsă între 100 și 1000 de nucleotide. Pentru fiecare dintre speciile (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. fortuitum), se găsesc 2 sau 3 fragmente ADN de diferite mărimi pentru fiecare enzimă de restricție. Combinația de fragmente ADN de dimensiuni diferite obținute permite acestor specii să se diferențieze între ele.

Se dezvoltă tehnologia microcipurilor biologice ADN. care vor ajuta la identificarea a mai mult de 100 de tipuri de micobacterii într-un studiu.

Identificarea speciilor poate fi de asemenea realizată prin amplificarea prin PCR a regiunii variabile 16S rRNA, urmată de secvențierea ampliconilor în comparație cu structura primară corespunzătoare, care permite identificarea a peste 40 de specii de micobacterii.

Folosind PCR, se poate realiza și identificarea speciilor în complexul de micobacterie tuberculoasă, incluzând diferențierea M. bovis și M. bovis BCG. Pentru aceasta, este analizată prezența sau absența anumitor gene în regiunile genomice ale RD1. RD9 și RD10. RD1 este absent în M. bovis BCG, dar este prezent în specii virulente, incluzând M. bovis.

Determinarea sensibilității la medicament a Mycobacterium tuberculosis folosind PCR

Sarcinile metodelor genetice moleculare pentru determinarea susceptibilității sau rezistenței la medicament a Mycobacterium tuberculosis sunt reduse la identificarea mutațiilor în anumite secvențe nucleotidice ale genelor cunoscute. Principalele metode se bazează fie pe citirea directă (secvențierea) acestor secvențe după amplificare, fie pe hibridizarea fragmentelor ADN marcate cu biotină amplificate în timpul PCR cu sonde ADN. Ambele alternative implică identificarea substituțiile de nucleotide în secvențele care utilizează sonde ADN duc la absența sau hibridizare incomplet la o membrană de nitroceluloză utilizând conjugat enzimă (streptavidin-fosfatază alcalină) - Metoda lipa-Rif-TB.

Metoda de măsurare a fluorescenței în sonde ADN fixate local la microsfere care sunt complementare mutațiilor cunoscute în regiunile amplificate prin PCR ale genelor responsabile pentru sensibilitatea sau rezistența la medicament se numește metoda microbiochip. Algoritmul de bază pentru realizarea acestui studiu este următorul. După izolarea ADN-ului dintr-o probă clinică sau o cultură de micobacterii este necesar să se efectueze PCR pentru a amplifica fragmentele corespunzătoare genei gRV responsabile pentru sensibilitatea medicamentului la rifampicină sau la genele katG și inhA care codifică proteinele micobacteriene responsabile de sensibilitatea la izoniazid. Rezultatele PCR sunt evaluate utilizând o electroforeză pe gel de agaroză, care confirmă prepararea fragmentelor ADN corespunzătoare cu lungimea dorită. Aceasta este urmată de a doua rundă de PCR pentru introducerea unei etichete fluorescente în ADN. Rezultatele PCR sunt confirmate din nou prin electroforeză pe gel. După aceea se efectuează hibridizarea (incubare peste noapte) urmată de spălarea materialului obținut pe un biochip, care este un număr mare de lanțuri scurte de ADN (sonde) fixate pe o placă de sticlă mică, complementară secvențelor de nucleotide ale Mycobacterium tuberculosis sensibile la medicamente în punctele posibilelor mutații. precum și secvențe mutante responsabile de rezistența la medicament. Aranjamentul sondelor ADN pe placă este strict determinat și se stabilește nivelul de fluorescență observat în timpul hibridării pentru a determina rezultatul utilizând un cititor special. În acest sens, rezultatele analizei sunt determinate folosind un program specializat de calculator.

În ultimii ani, au fost dezvoltate metode alternative pentru determinarea susceptibilității la medicament a Mycobacterium tuberculosis pe baza tehnologiei PCR în timp real, permițând efectuarea acestor studii în tuburi închise.

În fig. 13-13 prezintă rezultatul analizei culturilor clinice de Mycobacterium tuberculosis la determinarea rezistenței medicamentului la rifampicină folosind PCR în timp real: 218 - eșantion de control (sensibil la rifampicină); 93 - control pozitiv pentru mutația Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - control pozitiv pentru mutația Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - probe experimentale. Rezultatul calculului curbelor de amplificare cinetică pentru 4 canale: canalul 1: 393 - control pozitiv pentru mutația Ser-Trp TCG-TGG; canalul 2: 4482 - control pozitiv pentru mutația Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - probe experimentale; canalul 4: curbe cinetice de amplificare a tuturor probelor care participă la experiment. Reacție de amplificare de control pozitivă. Concluzii: rezultatele analizei au evidențiat următoarele mutații care determină rezistența la rifampicină: în probele 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Același principiu este utilizat pentru a determina rezistența medicamentului la izoniazid pentru genele katG și inhA, care determină cele mai frecvente mutații.

Identificarea tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis

Cel mai studiat minuțios metoda de identificare a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis este o tehnică numită restricție polimorfismul lungimii fragmentelor (RFLP RFLP,. Sau în versiunea în limba engleză) și care se bazează pe fragmentirovanin (restricție) a enzimei ADN de Mycobacterium tuberculosis Pvull și fragmentele obținute de hibridizare ulterioară cu anumite secvențe specifice de ADN elementul său repetat este IS6110. Variabilitatea intraspecifică se realizează datorită numărului diferit de repetări ale IS6110 și localizării acestora pe ADN. precum și diversitatea distanțelor dintre anumite puncte de atac ale restrictazei enzimei (situsurile de restricție) și elementul IS6110. Această tehnologie este foarte complexă și consumă mult timp. După tratamentul cu ADN-ul extras dintr-o cultură de Mycobacterium tuberculosis, electroforeză în gel este efectuată cu o enzimă de restricție, și apoi transferat fragmente ADN de diferite lungimi pe o membrană de nitroceluloză, hibridizare a fost efectuată cu fragmente de IS6110 element și detectat prin intermediul unor reacții enzimatice. Modelul specific rezultat al benzilor caracterizează ADN-ul unei tulpini specifice de Mycobacterium tuberculosis. Cu ajutorul analizei computerelor se dovedește că tulpinile sunt identice sau legate. Deși metoda RFLP este cea mai discriminativă, adică relevă cel mai mare număr de diferențe dintre tulpinile analizate și este ineficient cu un număr mic (mai puțin de 5) din repetările IS6110 observate în unele tulpini. În fig. 13-14 prezintă rezultatele tipăririi RFLP a tulpinilor.

O alternativă poate fi metoda de combinat (combinat) - o analiză a polimorfismului secvențelor de distanțare ADN - intermediar între repetările directe ale regiunii DR. Atunci când se efectuează combinarea tulpinilor, se efectuează PCR cu primeri care limitează regiunea DR, după care se formează fragmente de diferite lungimi care hibridizează cu regiuni intermediare variabile ale ADN-ului. Este prezentată analiza secvențelor distanțiere ale regiunii DR. conform cercetătorilor, mai simple, mai productive și mai potrivite pentru screening-ul primar al tulpinilor și analizei epidemiologice preliminare, precum și studiul materialului clinic direct.

Evident, o metodă mai eficientă și mai accesibilă din punct de vedere tehnologic este VNTR (abrevierea cuvintelor în limba engleză) sau o metodă pentru determinarea numărului variabil de repetări tandem precise în ADN-ul Mycobacterium tuberculosis. Această metodă se bazează numai pe utilizarea PCR și nu necesită manipulări suplimentare. Deoarece numărul repetițiilor tandem în diferite tulpini și în diferite loci este diferit, se determină fragmente de diferite mărimi și se analizează pe electroforegrama rezultată a produselor PCR. Potrivit cercetătorilor, utilizarea VNTR a atins un grad mai mare de discriminare a tulpinilor decât utilizarea metodei RFLP.

În ultimii ani, o atenție deosebită a fost acordată răspândirii tulpinilor Mycobacterium tuberculosis din familia W-Beijing (uneori se numesc tulpina din Beijing), care sunt în mare parte rezistente la medicamente.

Cerințe de bază pentru calitatea studiilor biologice moleculare

Documente de reglementare de bază pentru PCR

Ordonanțele Ministerului Sănătății din Rusia: Nr. 45 din 7 februarie 2000. Nr. 109 din 21 martie 2003. Nr. 64 din 21 februarie 2000. Orientări metodice: 1.3.1888-04 "Organizarea lucrărilor în timpul studiilor de PCR a materialului infectat cu patogeni biologici agenți ai grupurilor de patogenitate III-IV "; 1.3.1794-03 "Organizarea muncii în cazul studiilor PCR a materialului infectat cu microorganisme de patogenitate grupei I-II". 2003.; 3.5.5.1034-01 "Dezinfectarea materialului de testare infectat cu bacterii de patogenitate grupurilor I-IV la utilizarea metodei PCR", 2001. Anexa 11 la Instrucțiunea privind metodele unificate de cercetare microbiologică în detectarea, diagnosticarea și tratamentul tuberculozei.

Personalul

Doctorii de diagnostic clinic de laborator, bacteriologi, virologi, biologi ai laboratorului de diagnostic clinic, precum și specialiștii cu studii medii secundare care au făcut obiectul specializării și instruirii avansate în modul prescris pot efectua studii biologice moleculare.

Dispozitiv pentru laboratoare

Sunt necesare următoarele săli de laborator:

• Zona de prelucrare a eșantioanelor este un laborator adaptat pentru a lucra cu agenți infecțioși din grupele III-IV de patogenitate, în conformitate cu Orientările metodologice 13.1888-04.
• Zona pentru prepararea amestecurilor de reacții PCR - cameră de laborator, care asigură protecție împotriva contaminării interne a laboratorului - zona "curată".
• Dacă pentru analiza produselor PCR utilizând metoda de electroforeză sau hibridizare. camera de laborator în care fragmentele ADN propagate sunt extrase din tubul de amplificare și, prin urmare, pot fi eliberate în mediu, în conformitate cu cerințele laboratoarelor PCR (Indicații 1.3.1794-03, Ghidul 1.3.1888-04) trebuie să fie complet izolat de sediile indicate în paragrafele precedente. Trebuie să se excludă mișcarea din zona de electroforeză în zona de procesare a probelor și zona "curată" a oricărui personal, echipament, orice materiale și obiecte, precum și transferul de aer prin sistemul de ventilație sau ca urmare a curenților de aer. Această zonă nu este necesară pentru detectarea fluorimetrică a produselor PCR.
• Sala de documentare și prelucrare a rezultatelor este dotată cu calculatoare și echipamente de birou necesare. Echipamentul poate fi amplasat în această încăpere pentru a detecta produsele PCR fără a deschide tubul. - detectoare PCR fluorescente și termociclere pentru PCR în timp real.

Cerințele sanitare și epidemiologice pentru tratamentul primar al sputei sunt similare cerințelor microbiologice standard pentru lucrul cu micobacterii de tuberculoză.

Set complet de echipamente de laborator pentru diagnosticarea PCR

Pachetul de laborator include echipamente pentru următoarele încăperi.

• sala de preparare a probelor conține următoarele echipamente: clasa de protecție laminară II "SP-1.2": un termostat solid cu un capac încălzit pentru eprubete de tip Eppendorf; microcentrifuga la 13000 rpm; centrifugă ("Vortex"); un frigider cu o temperatură cuprinsă între -20 ° C și +10 ° C; pipete de volum variabil din seria Proline; pompă cu capcană OM-1; stativ cu pipetă; trepied la locul de muncă 200x0,5 ml; trepied la locul de muncă 50x1,5 ml; rafturi pentru tuburi de depozitare 80x1,5 ml;
• cameră pentru prepararea amestecului de reacție: cameră de protecție PCR-box ("Laminar-C, 110 cm); Centrifugă cu turbină; pipete de volum variabil din seriile progresive; stativ cu pipetă; trepied la locul de muncă 200x0,2 ml; rafturi pentru tuburi de depozitare 80x1,5 ml; un frigider cu o temperatură cuprinsă între -20 ° C și + 10 ° C;
• sala de electroforeză: cameră pentru electroforeză orizontală; sursa de alimentare; transiluminator;
• Amplificator de ADN sau analizor de acizi nucleici (PCR în timp real) cu un calculator și software; pot fi plasate în orice cameră liberă. Dacă folosiți tehnologia PCR în timp real. camera de electroforeză nu este necesară.

Controlul extern al calității

Pentru încrederea în obținerea de rezultate fiabile în mod obiectiv, laboratoarele ar trebui să participe la sistemul de evaluare externă a calității cercetării de laborator.

Participanții la sistemul de control al calității primesc; 12 fiole cu suspensii liofilizate de celule bacteriene, dintre care două conțin E. coli E. coli, 3 fiole cu tuberculoză mycobacterium (tulpină avirulentă) la o concentrație de 10 2 / ml; 3 fiole cu celule de tulpină similară la o concentrație de 10 4 / ml; 2 fiole cu micobacterii netuberculoase M. avium-intracellulare și M. kansasii la o concentrație de 10 5 / ml.

Testele distribuite pentru evaluarea externă a calității sunt testate în prealabil în două laboratoare independente cu o vastă experiență în acest domeniu.